Dom » Polikarbonat » Metode za određivanje mikotoksina i kontrolu kontaminacije hrane. Djelovanje mikotoksina na ljudsko tijelo

Metode za određivanje mikotoksina i kontrolu kontaminacije hrane. Djelovanje mikotoksina na ljudsko tijelo

Savremene metode detekcija i određivanje mikotoksina u hrani i hrani za životinje uključuje metode probira, kvantitativne analitičke metode i biološke metode.

Metode skrininga Brzi su i prikladni za šaržnu analizu, omogućujući vam brzo i pouzdano odvajanje kontaminiranih i nekontaminiranih uzoraka. Skrining metode uključuju tankoslojnu hromatografiju (TLC metode), fluorescentnu metodu za određivanje zrna kontaminiranih aflatoksinima.

Kvantitativne analitičke metode za određivanje mikotoksina prikazane su kemijskim, radioimunološkim i enzimskim imunološkim metodama. Trenutno su najčešće kemijske metode koje uključuju dvije faze: fazu izolacije i fazu za kvantitativno određivanje mikotoksina. Stupanj izolacije uključuje ekstrakciju (odvajanje mikotoksina od supstrata) i pročišćavanje (odvajanje mikotoksina od spojeva sličnih fizičko -kemijskih karakteristika). Konačno odvajanje i kvantificiranje mikotoksina provodi se različitim kromatografskim metodama. Tankoslojna hromatografija (TLC) univerzalna je metoda za određivanje svih vrsta mikotoksina.

Prilikom uzimanja uzoraka iz serije proizvoda, glavni zadatak je pribaviti prosječan uzorak ili prosječan uzorak, u smislu koncentracije mikotoksina, koja je reprezentativna za cijelu seriju (uzeti uzorci trebaju karakterizirati kvalitetu cijele serija). Ovaj zadatak ovisi o prirodi i distribuciji mikotoksina, karakteristikama proizvoda (sirovi, prerađeni, slobodno tekući, tekući, pastozni itd.) I načinu pripreme uzorka. Na primjer, kontaminacija kikirikija aflatoksinima ima izraženu heterogenu prirodu: njihov sadržaj u pojedinim zrnima kikirikija može se kretati od tisućinki miligrama do desetina ili više miligrama po 1 kg, odnosno razlikovati se za 5-6 redova veličine. Iz tog razloga, doprinos greške uzorkovanja ukupnoj analitičkoj grešci pri određivanju aflatoksina u kikirikiju je glavni i u nekim slučajevima može biti veći od 90%.

Sa stajališta ujednačenosti kontaminacije mikotoksinima, svi proizvodi se mogu podijeliti u dvije grupe: 1) proizvodi sa visokim stepenom heterogenosti (oguljeni i neoguljeni kikiriki, sjemenke ulja, cijela ili krupno mljevena zrna, orasi); 2) proizvodi ujednačenog zagađenja (tečnosti: mleko, biljna ulja, sokovi, pire; brašno, mleveno brašno).

Da biste dobili reprezentativan prosječan uzorak proizvoda l-ta grupa veličina početnog uzorka treba biti što je moguće veća (najmanje 2 kg), dok prosječni laboratorijski uzorak treba izolirati od mljevenog (homogeniziranog) prosječnog uzorka.

Za homogene proizvode druge grupe (džem, džem, voćni sokovi u malim limenkama, kondenziranom mlijeku, suhim mliječnim proizvodima itd.) uzorke treba uzeti u broju jedinica pakovanja koje odgovaraju veličini prosječnog uzorka (100-200 g), pod uvjetom da proizvod dolazi iz jedne serije.

Hemijske metode za detekciju i identifikaciju pojedinačnih aflatoksina temelje se na njihovoj specifičnoj fluorescenciji u UV svjetlu (oko 365 nm), na razlikama u pokretljivosti tokom tankoslojne hromatografije, na specifičnosti njihovog spektra apsorpcije i fluorescencije.

Za razliku od aflatoksina, trihoteceni ne pokazuju apsorpciju ili fluorescenciju u vidljivom dijelu spektra, što ih otežava otkrivanju tankoslojnom kromatografijom. Međutim, moguće je otkriti trihotecene pomoću TLC koristeći metode koje se temelje na obradi TLC ploča posebnim reagensima koji tvore obojene ili fluorescentne derivate s trihotecenima. Na primjer, toksin T -2 pri obradi ploča; koncentrirana sumporna kiselina stvara mrlje s plavom fluorescencijom;) na UV svjetlu.

Arbitražne metode za kvantitativno određivanje mikotoksina su sljedeće:

Plinsko-tekuća hromatografija (za toksin T-2);

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) pomoću UV fotometrijskog detektora (za deoksinivalenol i patulin);

HPLC pomoću detektora fluorescencije (za aflatoksine; i zearalenon).

Na sl. 2 prikazuje uređaj modernog tekućeg hromatografa u najjednostavnijem dizajnu.

Mobilnu fazu iz rezervoara 1 kroz ulazni filter 9 snabdeva pumpa visokog pritiska 2 u sistem za unos uzoraka 3 - ručni injektor ili auto -uzorkivač i tamo se ubrizgava uzorak. Zatim, kroz filter 8, uzorak sa strujom pokretne faze ulazi kroz predkolonu u kolonu za odvajanje 4. Zatim protok mobilne faze napušta kolonu i sadrži komponente smjese za odvajanje (eluat) ulazi detektor 5 i uklanja se u odvodni rezervoar 7. Kada eluat teče kroz mjerni krug detektora, vrši se registracija hromatograma i prijenos podataka na diktafon 6 ili na računar.

Uređaj za tečni hromatograf (izokratski sistem):

1 - kapacitet; 2 - sistem visokog pritiska; 3 - ručni injektor ili autosampler; 4 - razdjelna kolona; 5 - detektor; b - matičar ili računar; 7 - odvodni rezervoar; 8 - filter; 9 - ulazni filter

Sistem prikazan na Sl. 2 je izokratski: sastav pokretne faze se ne mijenja tokom hromatografije. Ako je tijekom kromatografske analize potrebno promijeniti koncentraciju jedne ili više komponenti pokretne faze, tada se koriste takozvani gradijentni sistemi, koji se obično sastoje od dvije ili više pumpi. U slučaju gradijentnog ispiranja, svako otapalo se dovodi iz posebne posude u posebnu komoru za miješanje s magnetskom miješalicom, gdje se, prema određenom programu, miješa sa zadanim omjerom volumena.

Za analizu mikotoksina često se koriste gradijentni sistemi, gdje se kao pokretna faza koriste otopine acetonitrila u vodi s linearno promjenjivom koncentracijom tijekom vremena.

Hromatografska kolona je metalna cijev od 150 do 250 mm s unutrašnjim promjerom od 4,6 mm, napunjena posebnim sorbentom na bazi silika gela sa cijepljenim ugljikovodičnim radikalima. Zaštitna kolona služi za zaštitu hromatografske kolone od kontaminacije.

UV fotometrijski detektor je najčešći tip HPLC detektora. Princip rada detektora sličan je principu rada konvencionalnog spektrofotometra: bilježi optičku gustoću otopine. Razlika je u tome što je UV detektor protočan, umjesto kivete s otopinom, koristi fotometrijsku ćeliju. Eluenski tok protiče kroz radnu ćeliju, a tok čiste pokretne faze usmjeren je kroz referentnu ćeliju. Izvor svjetlosti je živina lampa koja emitira intenzivno UV zračenje. Svjetlo željene valne duljine emitira se pomoću odgovarajućih optičkih filtera, prolazi kroz ćelije, djelomično ga apsorbiraju molekuli pokretne faze i odvojene komponente te se hvata fotodetektorom. Apsorpcija svjetlosti (optička gustoća) eluata kontinuirano se snima pomoću snimača ili računara, snimajući hromatogram. Odvojene komponente smjese (na primjer, mikotoksini) prikazane su na hromatogramu kao vrhovi. Položaj vrha u hromatogramu koristi se za identifikaciju tvari, a područje vrha za kvantitativno određivanje.

Sofisticiraniji uređaj je fluorescentni (fluorometrijski) detektor. Ovaj detektor koristi sposobnost organskih spojeva, posebno aflatoksina i zearalenona, da fluoresciraju kada su izloženi UV ili vidljivom zračenju. Detektor fluorescencije ima protočnu ćeliju s dva međusobno okomita optička kanala. Jedan od njih služi za opskrbu uzbudljivim zračenjem, a drugi omogućuje mjerenje intenziteta fluorescencije. U slučaju analize aflatoksina B 1 i M 1, talasna dužina pobude je 360 nm, a talasna dužina emitovanog zračenja 420 nm.

Treba napomenuti da se UV detektor može koristiti i za analizu aflatoksina, ali je njegova osjetljivost za red veličine niža od one fluorometrijskog detektora; stoga, pri analizi niskih koncentracija aflatoksina (na MPC razini i ispod) , poželjnije je otkrivanje fluorescencije.

D.M. Zubovsky, Državna ustanova "Bjeloruski državni veterinarski centar", glavni veterinar

Metoda je dalje razvijena pod nazivom tankoslojna hromatografija visokih performansi (HPTLC, HPTLC). Smanjenje debljine stacionarnog faznog sloja (do 100 mikrona) i veličine čestica (do 5 mikrona) dovelo je do boljeg odvajanja tvari u kraćem vremenskom periodu.
TLC metode su dostupne za gotovo sve mikotoksine. Otkrivanje i specifična identifikacija osmišljeni su za svaki pojedinačni mikotoksin koristeći molekularna svojstva ili reakcije transformacije.

Glavni nedostaci tankoslojne hromatografije su:
§ niska produktivnost;
§ Većina uzoraka zahtijeva analize prije ekstrakcije i pročišćavanja radi uklanjanja potencijalnih smetnji i spojeva matrice;
§ koncentracija analita mora biti u rasponu od 0,01-0,1%;
§ upotreba otrovnih i isparljive materije kao rastvarač.
Metode tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) u području istraživanja mikotoksina uglavnom se koriste za konačno odvajanje matriksnih spojeva i detekciju analita od interesa. HPLC metode danas su u širokoj upotrebi zbog svojih vrhunskih performansi i pouzdanosti u usporedbi s tankoslojnom hromatografijom. HPLC metode su razvijene za većinu glavnih mikotoksina u žitaricama i drugim poljoprivrednim proizvodima. Većina metoda je pouzdana i stabilna.
HPLC metoda temelji se na odvajanju analiziranog ekstrakta u stacionarnoj fazi hromatografske kolone (slika 3) (kolone C8 i C18 se češće koriste za analizu mikotoksina) i njihovoj daljoj identifikaciji i kvantitativnom određivanju pomoću posebnih detektora. Najčešći detektori za analizu mikotoksina danas su ultraljubičasti i fluorescentni.
Granice osjetljivosti HPLC metoda pomoću ovih detektora mogu biti do 1 μg / kg uzorka.
U literaturi je zabilježen razvoj HPLC metoda za istovremenu analizu više mikotoksina. Trihotecenski mikotoksini, posebno trihoteceni, analizirani su s posebnim uspjehom.

U praksi, za proučavanje hrane za životinje i hrane na terenu, uvjete proizvodnje i laboratorije za ispitivanje potrebne su metode koje omogućuju kvantitativna i brza istraživanja veliki broj uzorci za prisutnost mikotoksina, ako je moguće uz najmanje truda i financijskih sredstava.
Sve ove karakteristike zadovoljene su metodama zasnovanim na imunološkim reakcijama. Komercijalno dostupne imunološke metode za analizu mikotoksina temelje se na upotrebi specifičnih monoklonskih i poliklonskih antitijela protiv određenih toksina i općenito se dijele na:
§ metoda zasnovana na kolonama imunoafiniteta (IAC, IAC);
§ enzimski imunosorbentni test (ELISA, ELISA) (tabela 1).

Obično se imunoafinitetne kolone zapravo koriste za uklanjanje matriksnih jedinjenja iz uzorka i omogućavaju izolaciju i koncentraciju određenog mikotoksina.
Naknadno ispiranje toksina iz IAC -a omogućava kvantitativno određivanje korištenjem klasičnih analitičkih metoda. U slučaju imunološkog testa enzima, postupci čišćenja obično nisu tako intenzivni kao kod drugih analitičkih metoda. Homogenat ili ekstrakt uzorka koji sadrži mikotoksin ili se izravno kvantificira pomoću standardne mikrotitarske ploče ili testa ELISA epruvete ili se koristi enzimski imunosorbentni membranski test za kvalitativno ili polukvantitativno određivanje prisutnosti mikotoksina.
Druge metode za proučavanje mikotoksina primjenom imunološkog pristupa opisane u literaturi uključuju optičke i akustične biosenzore, kapilarnu elektroforezu.

Kolone sa imunoafinitetom obično se koriste za pročišćavanje testnog uzorka iz složenih matrica i koncentracije toksina prije otkrivanja i procjene sadržaja mikotoksina korištenjem brojnih klasičnih analitičkih metoda kao što su HPLC, plinska hromatografija, masena spektrometrija, fluorometrija, HPTLC i TLC. Metoda se sastoji od ubrizgavanja ekstrakta uzorka u kolonu koja sadrži matricu imunoafiniteta koja sadrži čvrstu fazu (npr. Zrnca agaroze) za koju su antitela na mikotoksin kovalentno vezana (slika 4). Molekula toksina sadržana u uzorku veže se na odgovarajuće imobilizirano antitijelo. Naredni koraci uključuju uklanjanje nevezanih komponenti matrice i ekstraktanta, eluiranje toksina promjenom sastava elucije i konačno otkrivanje toksina pomoću analitičkih metoda. Alternativno, mikotoksin vezan u koloni može se eluirati i direktno izmjeriti fluorometrijom na osnovu unutrašnje fluorescencije mikotoksina.
Membranski test omogućava kratak vremenski period (oko 10-15 minuta) da se odgovori na pitanje: da li su mikotoksini prisutni u uzorku za ispitivanje iznad granice osjetljivosti ovog testa? To je, u stvari, ovo je kvalitativno određivanje prisutnosti / odsutnosti mikotoksina u uzorku. Metoda zahtijeva ekstrakciju, filtriranje, pročišćavanje (kroz kolonu) i razrjeđivanje uzorka. Zatim se otopina nanosi na membranu osjetljivu na monoklonska antitijela, u koju se dodaje i konjugat enzima mikotoksina. Ako koncentracija mikotoksina u uzorku premaši granicu detekcije testa, sva se antitijela na površini vežu za njih i sav dodani konjugat se uklanja u koraku ispiranja. Kada se doda bezbojna podloga, konjugat katalizira reakciju boje na površini membrane, uslijed čega nastaje obojena mrlja na mjestu vezanja konjugata. Bojenje analitičke zone membrane ukazuje na odsutnost mikotoksina u uzorku.
Enzimski imunosorbentni test obično se koristi za praćenje prisutnosti mikotoksina iznad određene razine (ili njihovog nedostatka) u uzorku za ispitivanje. Trenutno je na raspolaganju niz kvalitativnih, polukvantitativnih i kvantitativnih metoda. Na temelju rezultata ELISA -e, sumnjive uzorke treba ponovno provjeriti klasičnim metodama. Dostupno razne opcije ELISA za analizu mikotoksina (npr. Membranski testovi, mikrotitarske ploče i metode cijevi). Obično se ELISA temelji na testu konkurenata koji koristi ili enzim-konjugirane mikotoksine ili antitijela protiv specifičnog toksina od interesa (slika 5). Tipičan slijed reakcija pomoću gotovih reagensa u formatu mikrotitarske ploče je sljedeći:
1. ekstrakt ispitnog uzorka dodaje se enzimski konjugat;
2. smjesa se dodaje odgovarajućim antitijelima nanesenim na površinu jamica ploče (na primjer, mikrotitarska ploča, obložena antitijelima);
3. količina konjugata vezana za toksin vezana imobiliziranim antitijelima ovisi o količini toksina u uzorku; što je veća količina toksina u uzorku, manja će biti količina enzimskog konjugata vezanog za antitijela nanesena na površinu jamica ploče i obrnuto;
4. Enzimska aktivnost konjugata vezanog za površinska antitijela određuje se dodatkom odgovarajućeg supstrata, što dovodi do stvaranja obojenih proizvoda čija je koncentracija obrnuto proporcionalna koncentraciji toksina u uzorku za ispitivanje.

Na bazi Bjeloruskog državnog veterinarskog centra, tokom 2004-2006 analiza sadržaja mikotoksina u hrani za životinje izvedena je pomoću enzimski imunosorbentnog testa. Za studiju smo koristili gotove testne sisteme proizvođača R-Biopharm, Njemačka. Ova kompanija proizvodi niz setova za kvantitativno određivanje mikotoksina: aflatoksine B, G, M, zearalenon, ohratoksin A, toksin T-2, deoksinivalenol, fumonizin B1, citrinin. Treba napomenuti da za gotovo sve navedene mikotoksine postoje testni sistemi za određivanje posebno niskih koncentracija ovih toksičnih spojeva s granicom osjetljivosti na nivou hromatografskih metoda (RIDASCREEN® mikotoksini) (vrijeme inkubacije 1-2 sata ) i ekspresne metode koje omogućuju određivanje praktično iste koncentracije 15-30 minuta (RIDASCREEN® FAST mikotoksini). Sve metode su odobrene u Republici Bjelorusiji i mogu se koristiti u laboratorijama koje su dio strukture Ministarstva. Poljoprivreda i hranu.
Organizacija analize mikotoksina u stočnoj hrani i hrani metodom enzimskog imunološkog ispitivanja moguća je s minimalnim sredstvima i u najvećoj mjeri kratko vrijeme... Lakoća rada i niska cijena potrebne opreme povoljno razlikuju imunološki test enzima od klasičnih metoda analize (Tablice 2, 3) i čine ga posebno atraktivnim za laboratorije s ograničenim financijskim sredstvima.
Valja napomenuti da su s praktički jednakim pokazateljima granica detekcije, enzimski imunološke metode ispitivanja produktivnije i dopuštaju selektivno proučavanje samo uzoraka sumnjivih ELISA-om instrumentalnim metodama. Na primjer, koristeći ELISA metodu, jedan laboratorijski pomoćnik može analizirati 10-100 uzoraka po jednoj radnoj smjeni, dok koristeći HPLC samo 1-10 uzoraka. U ovom slučaju, imunološki test enzima traje od 15 minuta do 3 sata (priprema uzorka do 1 sata), a HPLC-2-4 sata sa 1-3 dana pripreme uzorka.

Zaključci. Istraživanja koja su identificirala kontaminaciju hrane mikotoksinima u ovom razdoblju omogućila su dijagnosticiranje iznenadnih izbijanja bolesti na nekoliko poljoprivrednih gospodarstava u Republici, što je omogućilo primjenu odgovarajućih mjera i time smanjilo ekonomske gubitke proizvođača.
Troškovi pravovremenog proučavanja hrane za životinje vlastite proizvodnje, a još više kupljene u drugim zemljama, uvijek će biti niži od troškova provođenja hitne dijagnostike izbijanja bolesti, poduzimanja potrebnih mjera za upotrebu ili zbrinjavanje kontaminirane hrane za životinje, kao i gubitke uslijed smanjenja produktivnosti i uginuća životinja.

Literatura:
1. Bioaerosoli: Procjena i kontrola, 24.1.3. - ACGIH, Cincinnati, OH 1999.
2. Veterinarski i sanitarni standardi za sigurnost hrane za životinje i aditiva za hranu :: br. 48: odobren. Ministarstvo poljoprivrede i hrane Republike Bjelorusije od 28.04.08: ulaz. stupio na snagu 28.04.08.
3. Evropska mikotoksikološka informativna mreža. - http://www.mycotoxins.org
4. Uredba Komisije EU br. 466/2001 od 8. marta 2001. „Postavljanje maksimalno dozvoljenih nivoa za određene zagađivače u hrani“. - SL L 77, 16.3.2001. - str. 1.

Mikotoksini i metode za njihovo određivanje

Mikotoksini (od grčkog mykes - gljiva i toxikon - otrov) sekundarni su metaboliti mikroskopskih plijesni s izraženim toksičnim svojstvima. Velika opasnost od mikotoksina izražava se u činjenici da imaju toksični učinak u izuzetno malim količinama i da se mogu vrlo intenzivno difundirati u dubinu proizvoda.

Aflatoksini su članovi najopasnije grupe mikotoksina sa jakim hepatotoksinima i kancerogenim svojstvima. Aflatoksine proizvode različiti sojevi samo dvije vrste Aspergillus (Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus), koje su rasprostranjene u cijelom svijetu. Treba napomenuti da toksigene gljive mogu zaraziti biljne podloge ne samo tijekom skladištenja, već i tijekom njihovog rasta, berbe, transporta i prerade.

Porodica aflatoksina uključuje četiri glavna predstavnika (aflatoksine B 1, B 2, G 1, G 2), kao i više od 10 spojeva koji su derivati ili metaboliti glavne grupe (M 1, M 2, B 2a, G 2a , GM 1, P 1, Q 1, itd.).

V prirodnim uslovima Aflatoksini se češće i u najvećim količinama nalaze u sjemenkama kikirikija, kukuruza i pamuka. Osim toga, mogu se akumulirati u značajnim količinama u raznim orašastim plodovima, uljaricama, pšenici, ječmu, kakau i kavi, kao i u hrani za domaće životinje.

Treba napomenuti mogućnost pojave aflatoksina u proizvodima životinjskog podrijetla: u mlijeku, tkivima i organima životinja koje su primale hranu kontaminiranu aflatoksinima u visokim koncentracijama.

Dokazano je da krave izlučuju mlijekom 0,35 do 2-3% aflatoksina B 1 dobivenog hranom u obliku visoko toksičnog metabolita - aflatoksina M 1 Istodobno, pasterizacija mlijeka i proces sušenja ne značajno utiču na sadržaj aflatoksina M 1 u njemu. Aflatoksin M 1 pronađen je u punomasnom i suhom mlijeku, pa čak i u mliječnim proizvodima koji su podvrgnuti tehnološkoj preradi (pasterizacija, sterilizacija, pravljenje svježeg sira, jogurta, sireva itd.). Dakle, u procesu dobijanja sira iz kontaminiranog mlijeka, 50% aflatoksina M 1 se određuje u masi skute. Po prijemu maslaca 10% aflatoksina M 1 odlazi u vrhnje, 75% ostaje u obranom mlijeku.

Aflatoksini su slabo topljivi u vodi, netopivi u nepolarnim otapalima, ali su dobro topivi u srednje polarnim otapalima kao što su kloroform, metanol i dimetil sulfoksid. Oni su prilično nestabilni u kemijski čistom obliku i osjetljivi su na utjecaje zraka i svjetlosti.

Aflatoksini se praktički ne uništavaju tijekom normalnog kulinarskog izlučivanja kontaminiranih prehrambenih proizvoda.

Trihotecenski mikotoksini su sekundarni metaboliti mikroskopskih gljiva iz roda Fusarium, koje inficiraju hranu za životinje i hranu, uslijed čega se javlja prehrambena toksikoza kod životinja i ljudi. Najčešće se nalaze u zrnu kukuruza, pšenice i ječma. Mikotoksini ove grupe su sveprisutni, posebno u zemljama sa umjereno kontinentalnom klimom. Nije neuobičajeno da se dva ili više mikotoksina nađu u istom proizvodu. Prilikom provođenja obavezne certifikacije osigurana je kontrola nad sadržajem dva predstavnika ove grupe, naime deoksinivalenol i toksin T-2 su standardizirani.

Deoksinivalenol(DON), jedan od najčešćih fusariotoksina, inhibira sintezu proteina, smanjuje koncentraciju ytgunogaobulina u serumu krvi i može potisnuti reproduktivni sistem. Kontaminacija hrane za domaće životinje posebno je opasna. Dakle, DON izaziva povraćanje kod životinja, smanjuje unos hrane kod prasadi. T-2 toksin manje rasprostranjena, ali otrovnija od DON -a. T-2 toksin izaziva iritaciju, krvarenje i nekrozu u probavnom traktu. Akutnu intoksikaciju trihotecenom prati oštećenje hematopoetskih i imunološki kompetentnih organa. Karakterizira razvoj hemoragijskog sindroma, odbijanje hranjenja, povraćanje.

Zearalenon i njegove derivate također proizvode mikroskopske gljive iz roda Fusarium. Glavni prirodni supstrat u kojem se Zearalenon najčešće nalazi je kukuruz. Gljive iz roda Fusariurn graminearum često napadaju kukuruz u stojećem polju i uzrokuju truljenje kukuruza i stabljike. Kukuruz se takođe može kontaminirati Zearalenonom tokom skladištenja. Stopa detekcije zearalenona velika je u mješovitoj hrani, kao i u pšenici, ječmu i zobi. Među namirnicama je ovaj toksin pronađen u kukuruzno brašno, žitarice i kukuruzno pivo.

Zearalenon ima izražen estrogeni i teratogeni učinak te predstavlja ozbiljan problem za stočarstvo u mnogim zemljama, a sposobnost ovog mikotoksina da se nakuplja u tkivima domaćih životinja čini ga potencijalno opasnim za zdravlje ljudi. Kontaminacija stočne hrane zearalenonom uzrokuje smanjenu plodnost, pobačaj, neplodnost i upalne bolesti kod svinja, krava, peradi i zečeva. Unatoč tome, donedavno su se neki derivati zearalenona koristili kao stimulansi rasta kod životinja, a proizvodila ih je industrija.

Patulin je posebno opasan mikotoksin sa kancerogenim i mutagenim svojstvima. Glavni proizvođači patulina su mikroskopske gljive Penicillium patulum i Penicillium expansum. Proizvođači patulina uglavnom utječu na voće i neko povrće uzrokujući njihovo truljenje. Patulin se nalazi u jabukama, kruškama, kajsijama, breskvama, trešnjama, grožđu, bananama, jagodama, borovnicama, brusnicama, krkavini, dunji i paradajzu. Jabuke su najčešće pogođene patulinom, gdje sadržaj toksina može doseći 17,5 mg / kg. Treba napomenuti da se patulin nalazi ne samo u trulom dijelu voća i povrća, već i u normalnom dijelu. Na primjer, u rajčicama, patulin je ravnomjerno raspoređen po cijelom tkivu.

Patulin se također nalazi u visokim koncentracijama u prerađenom voću i povrću: sokovi, kompoti, mope i džemovi. Posebno se često nalazi u soku od jabuke (0,02-0,4 mg / l). Sadržaj patulina u drugim vrstama sokova: kruška, dunja, grožđe, šljiva, mango - kreće se od 0,005 do 4,5 mg / l.

Kontrola sadržaja mikotoksina obavezna je prilikom certificiranja prehrambenih sirovina i prehrambenih proizvoda. U Rusiji su usvojeni sanitarni i higijenski standardi za sadržaj mikotoksina u hrani, dati u tabeli. 12.

Sistem mjera za prevenciju mikotoksikoze uključuje sanitarne i mikološke analize prehrambenih proizvoda (slika 13).

Tablica 12. Dopuštene razine mikotoksina u određenim grupama hrane

Osim toga, velika se pozornost posvećuje pronalaženju načina za dekontaminaciju i detoksikaciju sirovina i prehrambenih proizvoda kontaminiranih mikotoksinima. U tu svrhu koriste se mehaničke, fizičke i kemijske metode:

1) mehanički- ručno odvajanje kontaminiranog materijala ili pomoću elektroničkih kalorimetrijskih razvrstavača;

2) fizički toplinska obrada, izlaganje ultraljubičastom zračenju;

3) hemijski- tretiranje otopinama oksidansa, jakih kiselina i baza.

Međutim, uporaba mehaničkih i fizičkih metoda pročišćavanja ne daje visok učinak, kemijske metode dovode do uništenja ne samo mikotoksina, već i korisnih hranjivih tvari, kao i do kršenja njihove apsorpcije.

Pirinač. 12.Sanitarno-mikrobiološka analiza prehrambenih proizvoda

14.8.1 Metode za određivanje mikotoksina

Savremene metode otkrivanja i određivanja sadržaja mikotoksina u hrani i hrani za životinje uključuju metode skrininga, kvantitativne analitičke metode i biološke metode.

Metode skriptiranja brze su i prikladne za serijsku analizu, omogućavajući brzo i pouzdano odvajanje kontaminiranih i nekontaminiranih uzoraka. Skrining metode uključuju tankoslojnu hromatografiju (TLC metode), fluorescentnu metodu za određivanje zrna kontaminiranih aflatoksinima.

Kvantitativne analitičke metode za određivanje mikotoksina prikazane su kemijskim, radioimunološkim i imunoenzimskim metodama. Trenutno su najčešće kemijske metode koje uključuju dvije faze: fazu izolacije i fazu za kvantitativno određivanje mikotoksina. Stupanj izolacije uključuje ekstrakciju (odvajanje mikotoksina od supstrata) i pročišćavanje (odvajanje mikotoksina od spoja sličnih fizičko -kemijskih karakteristika). Konačno odvajanje i kvantificiranje mikotoksina provodi se različitim kromatografskim metodama. Univerzalna metoda za određivanje svih vrsta mikotoksina je tankoslojna hromatografija (TLC).

u pojedinačnim zrnima kikirikija njihov sadržaj može biti u rasponu od hiljaditih dijelova miligrama do desetina ili više miligrama po 1 kg, tj. varirati za 5-6 redova veličine. Iz tog razloga, doprinos greške uzorkovanja ukupnoj analitičkoj grešci pri određivanju aflatoksina u kikirikiju je glavni i u nekim slučajevima može biti veći od 90%.

Sa stajališta ujednačenosti kontaminacije mikotoksinima, težinu proizvoda možemo podijeliti u dvije grupe: 1) proizvodi sa visokim stepenom heterogenosti (oguljeni i neoguljeni kikiriki, sjemenke ulja, cijela ili krupna zrna, orasi); 2) proizvodi sa ujednačenim karakterom zagađenja (tečnosti: mleko, biljna ulja, sokovi, obala; brašno, mleveno brašno).

Da bi se dobio reprezentativan prosječan uzorak proizvoda iz grupe 1, veličina početnog uzorka trebala bi biti što je moguće veća (najmanje 2 kg), dok bi prosječni laboratorijski uzorak trebao biti izoliran od mljevenog (homogeniziranog) prosječnog uzorka.

Za homogene proizvode druge grupe (džem, džem, voćni sokovi u malim limenim posudama, kondenzirano mlijeko, suhi mliječni proizvodi itd.) Uzorke treba uzeti u broju jedinica pakovanja koji odgovaraju veličini prosječnog uzorka (100 -200 g), pod uvjetom da proizvod dolazi iz iste serije.

Za razliku od aflatoksina, trihoteceni ne pokazuju apsorpciju ili fluorescenciju u vidljivom dijelu spektra, što ih otežava otkrivanju tankoslojnom kromatografijom. Međutim, moguće je otkriti trihotecene pomoću TLC koristeći metode koje se temelje na obradi TLC ploča posebnim reagensima koji tvore obojene ili fluorescentne derivate s trihotecenima. Na primjer, toksin T-2, kada se tretira koncentriranom sumpornom kiselinom, stvara mrlje s plavom fluorescencijom na UV svjetlu.

Arbitražne metode za kvantitativno određivanje mikotoksina su sljedeće:

Plinsko-tekuća hromatografija (za toksin T-2);

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) pomoću UV fotomustričnog detektora (za deoksinivalenol i patulin);

HPLC pomoću fluorescentnog detektora (za aflatoksipe i zearalenon).

Za analizu mikotoksina često se koriste gradijentni HPLC sistemi, gdje se kao pokretna faza koriste otopine acetonitrila u vodi s linearno promjenjivom koncentracijom tijekom vremena.

Hromatografska kolona je metalna cijev od 150 do 250 mm dužine sa unutrašnjim promjerom od 4,6 mm, napunjena posebnim sorbentom na bazi silika gela sa cijepljenim ugljikovodičnim radikalima. Zaštitna kolona služi za zaštitu hromatografske kolone od kontaminacije.

UV fotomeorski detektor je najčešći tip HPLC detektora. Princip rada detektora sličan je principu rada konvencionalnog spektralnog fotometra: bilježi optičku gustoću otopine. Razlika je u tome što je UV detektor protočan, umjesto kivete s otopinom, koristi fotometrijsku ćeliju. Eluenski tok protiče kroz radnu ćeliju, a čisti pokretni fazni tok je usmjeren kroz referentnu ćeliju. Izvor svjetlosti je živina lampa koja emitira intenzivno UV zračenje. Svjetlo željene valne duljine emitira se pomoću odgovarajućih optičkih filtera, prolazi kroz ćelije, djelomično ga apsorbiraju molekuli pokretne faze i odvojene komponente te se hvata fotodetektorom. Apsorpcija svjetlosti (optička gustoća) eluata kontinuirano se snima pomoću diktafona ili računara, snimajući hromatogram. Odvojene komponente smjese (na primjer, mikotoksini) prikazane su na hromatogramu kao vrhovi. Položaj vrha u hromatogramu koristi se za identifikaciju tvari, a područje vrha za kvantitativno određivanje.

Treba napomenuti da se UV detektor može koristiti i za analizu aflatoksina; međutim, njegova osjetljivost je za red veličine niža od one fluorometrijskog detektora; stoga, pri analizi niskih koncentracija aflatoksina (na MPC razini i ispod ), bolje je otkrivanje fluorescencije.

Predlaže se ekspresna, sigurna i ekonomična metoda za određivanje mikotoksina u proizvodima životinjskog i biljnog porijekla. Određivanje se vrši iz uzorka od 2 g, pročišćeni ekstrakt QuEChERS-a je podijeljen na tri dijela po 2 ml i koristi se kao disperzator 300 μl kloroforma u mikroekstrakciji disperzivna tekućina-tekućina. Dobiveni ekstrakti se odnesu u mikroflakone, otapalo se ispari, a ostatak u prvom i trećem mikroflakonu otopi se u 50 μl acetonitrila, u drugom - u 50 μl heksana. U prvom mikroflakonu aflatoksini (B1, B2, G1, G2), zearalenon i okratoksin A određuju se pomoću HPLC s fluorometrijskim detektorom; u drugom, mikotoksini trihotocena (deoksinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2 acetildeoksinivalenol), patulin, ohratoksin A i zearalenon plinsko-tekućinskom hromatografijom s detektorom hvatanja elektrona, u trećem-patulin i zearalenon pomoću HPLC s detektorom u nizu dioda. Određivanje mikotoksina traje 1,5-2 sata uz istovremeni rad na 3 hromatografa. Za pripremu uzorka potrebno je 10,1 ml acetonitrila, 0,9 ml kloroforma i 0,05 ml heksana. Korištenje različitih mogućnosti kromatografije za određivanje patulina, zearalenona, ohratoksina A dovodi do pouzdanijih rezultata analize. 1 tbl, 1 pr

Izum se odnosi na prehrambenu i prerađivačku industriju i može se koristiti za određivanje sadržaja mikotoksina u prehrambenim proizvodima, žitaricama, stočnoj hrani i mesu radi procjene njihove sigurnosti.

Metode za određivanje svih standardiziranih mikotoksina iz jednog uzorka trenutno nisu predložene. Poznate su metode za određivanje pojedinačnih mikotoksina ili pojedinih klasa.

Dakle, za određivanje zearalenona, T-2, ohratoksina A, koristi se tankoslojna hromatografija za svaki toksin zasebno (GOST 28001-88. Metode za određivanje mikotoksina T-2, zearalenona i ohratoksina A. Krmna zrna, proizvodi od njega prerada, miješana hrana). Metoda je izuzetno složena, dugotrajna i omogućava polukvantitativno određivanje naznačenih mikotoksina svakog posebnog uzorka.

Poznata metoda za određivanje aflatoksina (B1, B2, G1, G2) tečnom hromatografijom visokih performansi sa fluorometrijskom detekcijom (GOST R 53162-2008. Prehrambeni proizvodi. Određivanje aflatoksina B1 i ukupnog sadržaja aflatoksina B1, B2, G1 , G2). Aflatoksini se ekstrahiraju metanolom, ekstrakt se pročišćava i koncentrira na koloni sa imunoafinitetom, eluira s metanolom, upari do male zapremine i kromatografira. Tehnika je dugotrajna, skupa i zahtijeva primjenu veliki broj otapala.

Poznata metoda za određivanje deoksinivalenola (GOST R 51116-97. Krmna smjesa, zrno, proizvodi njegove prerade. Metoda određivanja sadržaja deoksinivalenola), zasnovana na ekstrakciji mikotoksina iz uzorka acetonitrilom, prečišćavanjem ekstrakta na dvije uzastopne kolone sa ugljem, eluiranje deoksinivalenola sa acetonitrilom, do zapremine isparavanja i analiza tečnom hromatografijom sa UV detektorom. Međutim, predložena metoda je dugotrajna, naporna i ne dopušta istovremeno određivanje svih mikotoksina.

Poznata metoda za određivanje patulina (RF patent br. 2056044, G01N 33/02. Metoda za kvantitativno određivanje patulina u hrani), zasnovana na ekstrakciji patulina iz uzorka etil acetatom, prečišćavanjem ekstrakta na adsorbent, koncentracija ekstrakta i analiza tekućinskom hromatografijom. Tehnika je dugotrajna i zahtijeva upotrebu velikog broja otapala.

Poznata metoda za istovremeno određivanje trihotecenskih mikotoksina i zearalenona u zrnu plinskom hromatografijom-masenom spektrometrijom (Toshitsuga Tanaka i sur. Istovremeno određivanje mikotoksina trihotecena i zearalenona u žitaricama plinskom hromatografijom-masena spektrometrija / J. Chromatogr. A. 2000. 882. .23-28). Njegova suština leži u ekstrakciji mikotoksina iz 10 g uzorka od 100 ml acetonitrila 30 minuta, uklanjanju masti ekstrakcijom sa 20 ml heksana, isparavanjem ekstrakta acetonitrila do suha, otapanjem suhog ostatka u smjesi metanola sa kloroformom, prečišćavanje ekstrakta na koloni sa Florisilom, isparavanje ekstrakta do suva, rastvaranje ostatka u 2 ml metanola, derivatizacija sa tetrametilsilanom i zatim hromatografija. Metoda je dugotrajna, naporna i skupa.

Poznata metoda za istovremeno određivanje aflatoksina, ohratoksina A i zearalenona u zrnu hromatografijom visokih performansi s fluorometrijskim detektorom (Gobel R., Lusky K. Istovremeno određivanje aflatoksina, ohratoksina A i zearalenona u zrnima pomoću nove imunoafinitetne kolone / tekućine) hromatografija / zagađivači hrane 2004. V.87. br. 2. P.411-418). Njegova suština je ekstrahovanje mikotoksina iz uzorka od 25 g 100 ml rastvora acetonitrila, pročišćavanje ekstrakta na koloni sa imunoafinitetom, ekstrahovanje 2 ml metanola iz kolone mikotoksina, isparavanje ekstrakta do suva, rastvor ostatka u heksanu, derivatizacija ostatak sa trifluorooctenom kiselinom do suha, ispari otopinu do suhog 15 minuta metanolom i određivanje mikotoksina na različitim valnim duljinama (aflatoksini - 360-440 nm, zearalenon - 276-466 nm i ohratoksin A - 330-460 nm). Metoda je dugotrajna i naporna i zahtijeva veliku količinu otapala.

Najbliža predloženoj metodi je metoda za istovremeno određivanje aflatoksina u proizvodima od žitarica (Campone L., Piccinelli AL, Cetano R., Rastrelli L. Primjena disperzivne tekućine-tekućina mikroekstrakcije za određivanje aflatoksina B1, B2, G1, G2 u proizvodima od žitarica / J Chromatogr. A 2011 1248 str. 7548-7554). Njegova suština je ekstrahovanje mikotoksina iz uzorka od 25 g 100 ml rastvora metanola, uklanjanje masti ekstrakcijom sa 6 ml heksana, pročišćavanje 1 ml ekstrakta pomoću disperzivne tečne-tečne mikroekstrakcije sa hloroformom (220 μl), uklanjanje hloroforma, otopiti ostatak u 0,1 ml metanola i odrediti aflatoksine pomoću PELC -a sa fluorometrijskim detektorom. Faktor koncentracije mikotoksina je 2,0-2,5. Međutim, metoda je dugotrajna, zahtijeva veliku količinu otapala, nizak koeficijent koncentracije i ne omogućuje određivanje drugih mikotoksina iz istog ekstrakta. Trajanje analize samo na aflatoksine je 1,5-2 sata.

Svrha izuma je skratiti trajanje analize, povećati ponovljivost i pouzdanost rezultata analize, smanjiti potrošnju organskih otapala i osigurati sigurnost operatera.

Ovaj cilj postiže se činjenicom da se prema metodi za određivanje mikotoksina, uključujući uzorkovanje, ekstrakcija mikotoksina acetonitrilom u prisutnosti sredstava za izlučivanje, pročišćavanje ekstrakta u velikim količinama sorbensa (metoda pripreme uzoraka prema QuEChERS-u, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck FJ // J. AOAC Int. 2003. V.86. Br. 2. P.412), centrifugiranje i određivanje kromatografskim metodama. U predloženoj metodi ekstrakcija se vrši iz 2 g uzorka, pročišćeni ekstrakt se dijeli na tri dijela od po 2 ml i koristi se kao disperzator u disperzijskoj mikroekstrakciji tekućina-tekućina uz dodatak prvog dijela (za određivanje aflatoksina, ohratoksina A i zearalenona) 300 μl kloroforma koji sadrži 0,05% joda, do drugog (za određivanje mikotoksina trihotocena, patulina, zearalenona, ohratoksina A) - 300 μl kloroforma koji sadrži 50 μl trifluorooctenog anhidrida, (za određivanje patulina i zearalenona) - 300 μl kloroforma, zatim se dobivene smjese ubrizgavaju svaka posebno pomoću štrcaljke u 5 ml vode u epruveti za centrifugu kapaciteta 15 ml sa stožastim dnom, inkubirane 30 s u ultrazvučnoj kupelji, centrifugiranom na 3000 o / min tijekom 5 minuta, donji slojevi ekstrakta se uzimaju u mikrovijale, otapalo se čisti dušikom, a ostatak u prvom i trećem mikroflakonu otopi u 50 μl acetonitrila, u drugom - u 50 μl heksana, u prvom m Ikroflakoni određuju aflatoksine (B1, B2, G1, G2), ohratoksin A i zearalenon pomoću HPLC s fluorometrijskim detektorom, u drugom- mikotoksine trihocene (deoksinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooksiskirpenol, 13 i zearalenon, ohratoksin A) plinsko-tekućinskom hromatografijom s detektorom hvatanja elektrona, u trećem-patulin i zearalenon HPLC-om s detektorom u nizu dioda.

Primjer određivanja mikotoksina. Stavite 2.000 g usitnjenog proizvoda (zrno, stočna hrana, meso) u epruvetu kapaciteta 50 ml, dodajte 10 ml acetonitrila i 10 ml vode, snažno mućkajte 5 minuta, ulijte mješavinu soli (4 g magnezijum sulfata, 1 g natrijum hlorida, 1 g natrijum citrat monohidrata i 0,5 g natrijum citrat 1,5-vode), poklopite i snažno protresite 1-2 minute, a zatim centrifugirajte 5 minuta na 3000 o / min. Odnesite 8 ml dobijenog ekstrakta u epruvetu od 15 ml koja sadrži 0,9 g magnezijum sulfata, 0,2 g Bondesil PSA i C18 sorbenata, snažno mućkajte 1-2 minute, zatim centrifugirajte 5 minuta pri 3000 o / min.

U tri epruvete uzima se 2 ml dobijenog ekstrakta. U prvi se dodaje 300 μl kloroforma koji sadrži 0,05% joda, u drugi - 300 μl kloroforma koji sadrži 50 μl anhidrida trifluorooctene kiseline, u treći - 300 μl kloroforma, zatim se dobivene smjese svaka posebno ubrizgava pomoću štrcaljke u 5 ml vode u koničnim epruvetama za centrifugu, inkubirane 30 s u ultrazvučnoj kupelji i centrifugirane na 3000 o / min 5 minuta, donji slojevi ekstrakata se odvode u mikroflakone, otapalo se čisti dušikom, a ostatak u prva i treća mikro flakona otopljene su u 50 μl acetonitrila, u drugoj - u 50 μl heksana.

U prvoj mikroflakoni, aflatoksini (B1, B2, G1, G2), ohratoksin A i zearalenon određuju se pomoću HPLC pomoću fluorometrijskog detektora. Kromatografski uslovi: kolona "Kromasil C18", 150 mm, pokretna faza acetonitril / voda (30/70), zapremina uzorka 10 μl, talasna dužina pobude 340 nm, detekcija 450 nm za aflatoksine, 330-460 nm za ohratoksin A i 276-460 za Zearalenone.

U drugom, trikotocenski mikotoksini (deoksinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooksisirpetol, 13-acetildeoksinivalenol, 15-acetildeoksinivalenol), zearalenon, patulin, ohratoksin A pomoću plinsko-tekuće hromatografije s detektorom. Kromatografski uvjeti: kapilarni stupac "OPTIMA ® - 5 - Accent" (Macherey - Nagel, Njemačka, 30 m), temperatura termostata kolone 120 ° S, temperatura isparivača 200 ° S, detektor 300 ° S. Temperatura stupastog termostata je 120-310 ° C (brzina zagrijavanja 15 ° / min), nosivi plin je dušik, volumen ubrizganog uzorka je 1 μL bez podjele protoka.

U trećem - patulin i zearalenon pomoću HPLC -a sa detekcijom nizova dioda. Kromatografski uslovi: hromatografska kolona "XTerra RP18", 150 mm, pokretna faza - acetonitril / voda (gradijent 4-80% acetonitrila), brzina dotoka mobilne faze 1 ml / min, zapremina injektiranog uzorka 10 μl, detekcija na analitičkim talasnim dužinama 236 i 270 nm.

Glavne metrološke karakteristike određivanja mikotoksina u optimalnim uslovima ovom metodom sa uvedenim dodavanjem standarda mikotoksina u žito, meso i hranu za životinje u tri nivoa koncentracije prikazane su u tabeli.

Trajanje određivanja mikotoksina navedenih u tablici je 1,5-2 sata uz istovremeni rad na 3 kromatografa. Za pripremu uzorka potrebno je 10,1 ml acetonitrila, 0,9 ml kloroforma i 0,05 ml heksana. Koeficijent koncentracije je približno 3 puta veći u odnosu na prototip, što dovodi do osjetljivijeg određivanja ovih mikotoksina. Korištenje različitih mogućnosti kromatografije za određivanje patulina, zearalenona, ohratoksina A dovodi do pouzdanijih rezultata analize.

sto
Osnovne metrološke karakteristike za određivanje mikotoksina
	Vrijeme zadržavanja, t R, min	Određeni raspon sadržaja, mg / kg		Faktor koncentracije, K
Mikotoksin			Uvedeno, mg / kg		Stopa oporavka, R,%

IN 1	24,2	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	100-109
IN 2	10,3	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,2-7,8	88-91
G1	20,6	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	98-100
G2	8,2	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005:0,001	7,6-7,8	86-98
T-2	19,7	0,01-3	0,01; 1,0; 2,0	6,1-7,3	80-90
NT-2	18,1	0,003-0,3	0,005;0,01;0,1	6,4-6,9	82-83
DON	14,2	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	7,6-8,9	98-100
zone	18,7	0,01-2	0,01: 1,0; 2,0	6,8-7,5	87-94
3-ADON	16,5	0,01-2	0,01:1,0:2,0	6,8-7,5	89-97
15-ADON	15,7	0,01-2	0,005:0,01:0,1	6,1-7,7	87-88
Nivalenol	14,3	0,003-0,3	0,005:0,01:0,1	6,4-7,5	85-97
DAS	16,7	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	6,0-7,3	76-98
OTA	11,4	0,002-0,2	0,005:0,01:0,1	6,5-7,7	87-96
Patulin	7,1	0,01-2	0,01; 1,0: 2,0	6,8-7,8	89-96
DON - deoksinivalenol, ZON - zearalenon, 13, 15 -ADON - acetildeoksinivalenol, DAS - diacetooksisirpenol, OTA - ohratoksin A

TVRDITI

Metoda za određivanje mikotoksina u proizvodima životinjskog i biljnog podrijetla, uključujući uzorkovanje, ekstrakciju mikotoksina acetonitrilom u prisutnosti sredstava za izlučivanje, pročišćavanje ekstrakta masovnim sorbentima (metoda pripreme uzoraka prema QuEChERS-u), centrifugiranje i Određivanje kromatografskim metodama, naznačeno time da se ekstrakcija mikotoksina vrši iz 2 g uzorka, pročišćeni ekstrakt se dijeli na tri dijela, svaki po 2 ml i koristi se kao disperzator u disperzivnoj mikroekstrakciji tekućina-tekućina uz dodatak prvi dio (za određivanje aflatoksina, zearalenona i ohratoksina A) 300 μl kloroforma koji sadrži 0,05% joda, do drugog (za određivanje mikotoksina trihotocena, patulina, zearalenona, ohratoksina A) - 300 μl kloroforma koji sadrži 50 μl trifluoroctene kiseline anhidrida, na treći (za određivanje patulina i zearalenona) - 300 μl kloroforma, zatim se dobivene smjese ubrizgavaju svaka posebno pomoću štrcaljke u 5 ml vode, smještene u centrifugi oznaka kapaciteta 15 ml sa stožastim dnom, inkubirana 30 s u ultrazvučnoj kupelji, centrifugirana na 3000 o / min 5 minuta, donji slojevi ekstrakta odvedeni su u mikroflakone, otapalo je pročišćeno dušikom, a ostatak u prvi i treći mikroflakon otopljeni su u 50 μl acetonitrila, u drugom - u 50 μl heksana, u prvom mikroflakonu, aflatoksini (B1, B2, G1, G2), zearalenon i ohratoksin A određuju se HPLC -om pomoću fluorometrije detektor, u drugom-trihotocenski mikotoksini (deoksinivalenol, nivalenol, NT-2, Tox-2, 13-, 15-acetildeoksinivalenol), patulin, ohratoksin A i zearalenon plinsko-tekućinskom hromatografijom s detektorom hvatanja elektrona, u trećem- patulin i zearalenon pomoću HPLC-a sa detektorom u nizu dioda.

Metode određivanja mikotoksina

Savremene metode detekcije i određivanja sadržaja mikotoksina u hrani i hrani za životinje uključuju metode skrininga, kvantitativne, analitičke i biološke metode. Metodologija mikotoksina razvija se vrlo brzo. Broj razvijenih metoda i različitih modifikacija već je dosegao nekoliko stotina i nastavlja rasti.

Metode skrininga koje su jednostavne i brze za analizu omogućuju vam da brzo i pouzdano "uklonite" nezagađene uzorke. To uključuje tako raširene metode kao što je otkrivanje aflatoksina, ohratoksina A i zearalenona u mini koloni; TLC metode za istovremeno određivanje do 30 različitih mikotoksina; fluorescentno otkrivanje kontaminacije aflatoksinima itd.

Kvantitativne analitičke metode za određivanje mikotoksina mogu se podijeliti na hemijske, radioimunohemijske i enzimske imunotestove. Kemijske metode su trenutno najčešće i uključuju uzastopne faze izolacije i stvarno kvantitativno određivanje mikotoksina. Faza izolacije sastoji se od dvije faze: ekstrakcija - odvajanje mikotoksina od supstrata i pročišćavanje - odvajanje mikotoksina od spojeva sličnih fizičko -kemijskih karakteristika. Konačno odvajanje mikotoksina provodi se jednodomnom ili dvodimenzionalnom tankoslojnom kromatografijom (TLC) na pločama silikagela u različitim sistemima otapala, plinskom i plinsko-tekućinskom hromatografijom, tečnom hromatografijom visokih performansi i masenom spektrometrijom. Kvantitativno određivanje mikotoksina obično se vrši direktnim poređenjem intenziteta fluorescencije tokom TLC u ultraljubičastom svjetlu sa standardima poznatih koncentracija, vizuelno i denzitometrijski. Kako bi se povećala pouzdanost metoda, koriste se različiti potvrdni testovi zasnovani na pripremi derivata mikotoksina s različitim hromatografskim, kolorimetrijskim ili fluorimetrijskim karakteristikama.

Posljednje godine karakterizira povećana pažnja razvoju visoko osjetljivih i visoko specifičnih radioimunohemijskih i enzimskih imunoloških metoda za otkrivanje, identifikaciju i kvantifikaciju mikotoksina. Ove se metode temelje na dobivanju antiseruma za konjugate mikotoksina s goveđim serumskim albuminom. Prednost im je izuzetna osjetljivost, koja omogućuje otkrivanje pikograma mikotoksina i razvoj u smjeru automatizacije procesa određivanja. Biološke metode, koje obično nisu previše specifične i osjetljive, koriste se uglavnom za otkrivanje mikotoksina za koje ne postoje kemijske metode analize, ili kao potvrdni testovi. Ispitni objekti su različiti mikroorganizmi, pileći embriji, mnoge laboratorijske životinje, kulture stanica i tkiva.

Pregledi