rumah » polikarbonat » Metode untuk penentuan mikotoksin dan pengendalian kontaminasi makanan. Aksi mikotoksin pada tubuh manusia

Metode untuk penentuan mikotoksin dan pengendalian kontaminasi makanan. Aksi mikotoksin pada tubuh manusia

Metode modern deteksi dan penentuan mikotoksin dalam makanan dan pakan meliputi metode penyaringan, metode analisis kuantitatif dan metode biologis.

Metode penyaringan Mereka cepat dan nyaman untuk analisis batch, memungkinkan Anda dengan cepat dan andal memisahkan sampel yang terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Metode penyaringan meliputi kromatografi lapis tipis (metode KLT), metode fluoresensi untuk penentuan butir yang terkontaminasi aflatoksin.

Metode analisis kuantitatif untuk penentuan mikotoksin disajikan dengan metode kimia, radioimunologi dan immunoassay enzim. Saat ini, yang paling umum adalah metode kimia, yang mencakup dua tahap: tahap isolasi dan tahap penentuan kuantitatif mikotoksin. Tahap isolasi meliputi ekstraksi (pemisahan mikotoksin dari substrat) dan pemurnian (pemisahan mikotoksin dari senyawa dengan sifat fisikokimia yang mirip). Pemisahan akhir dan kuantifikasi mikotoksin dilakukan dengan menggunakan berbagai metode kromatografi. Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah metode universal untuk penentuan semua jenis mikotoksin.

Saat mengambil sampel dari batch suatu produk, tugas utamanya adalah mendapatkan sampel rata-rata atau sampel rata-rata, dalam hal konsentrasi mikotoksin, yang mewakili seluruh batch (sampel yang diambil harus mencirikan kualitas seluruh kelompok). Penyelesaian tugas ini tergantung pada sifat dan distribusi mikotoksin, karakteristik produk (mentah, diproses, mengalir bebas, cair, pucat, dll.), dan metode persiapan sampel. Misalnya, kontaminasi kacang tanah dengan aflatoksin memiliki sifat heterogen yang nyata: dalam biji-bijian kacang individu, kandungannya dapat berkisar dari seperseribu miligram hingga puluhan miligram atau lebih per 1 kg, yaitu, berbeda 5-6 kali lipat. Untuk alasan ini, kontribusi kesalahan pengambilan sampel terhadap kesalahan analisis total dalam penentuan aflatoksin dalam kacang tanah adalah yang utama dan dalam beberapa kasus bisa lebih dari 90%.

Dari sudut pandang keseragaman kontaminasi mikotoksin, semua produk dapat dibagi menjadi dua kelompok: 1) produk dengan tingkat heterogenitas yang tinggi (kacang yang dikupas dan tidak dikupas, biji minyak, biji-bijian utuh atau digiling kasar, kacang); 2) produk dengan karakter kontaminasi yang seragam (cairan: susu, minyak sayur, jus, puree; tepung, tepung giling).

Untuk mendapatkan sampel produk rata-rata yang representatif grup ke-l ukuran sampel asli harus sebesar mungkin (minimal 2 kg), sedangkan sampel laboratorium rata-rata harus diisolasi dari sampel rata-rata yang digiling (dihomogenkan).

Untuk produk homogen dari kelompok ke-2 (selai, selai, jus buah dalam kaleng kecil, susu kental, produk susu kering, dll.), sampel harus diambil dalam jumlah unit pengemasan yang sesuai dengan ukuran sampel rata-rata (100-200 g), asalkan produk berasal dari satu batch.

Metode kimia untuk deteksi dan identifikasi aflatoksin individu didasarkan pada fluoresensi spesifiknya dalam sinar UV (sekitar 365 nm), pada perbedaan mobilitas selama kromatografi lapis tipis, pada spesifisitas penyerapan dan spektrum fluoresensinya.

Tidak seperti aflatoksin, trichothecenes tidak memiliki penyerapan atau fluoresensi di bagian spektrum yang terlihat, yang membuatnya sulit untuk dideteksi dalam kromatografi lapis tipis. Namun, adalah mungkin untuk mendeteksi trikothesen dengan KLT menggunakan metode yang didasarkan pada pemrosesan pelat KLT dengan reagen khusus yang membentuk turunan berwarna atau fluoresen dengan trikotesen. Misalnya, toksin T -2 saat memproses piring; asam sulfat pekat membentuk bintik-bintik dengan fluoresensi biru;) dalam sinar UV.

Metode arbitrase untuk penentuan kuantitatif mikotoksin adalah sebagai berikut:

Kromatografi gas-cair (untuk toksin T-2);

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan detektor fotometrik UV (untuk deoxynivalenol dan patulin);

HPLC menggunakan detektor fluoresensi (untuk aflatoksin; dan zearalenon).

dalam gambar. 2 menunjukkan perangkat kromatografi cair modern dalam desain paling sederhana.

Fase gerak dari tangki 1 melalui filter saluran masuk 9 disuplai oleh pompa bertekanan tinggi 2 ke sistem pengenalan sampel 3 - injektor manual atau autosampler, dan sampel disuntikkan di sana. Kemudian melalui filter 8, sampel dengan arus fase gerak masuk melalui pra kolom ke kolom pemisah 4. Kemudian aliran fase gerak meninggalkan kolom dan berisi komponen campuran yang akan dipisahkan (eluat) masuk detektor 5 dan dipindahkan ke tangki pembuangan 7. Ketika eluat mengalir melalui pengukuran rangkaian detektor adalah pendaftaran kromatogram dan transfer data ke perekam 6 atau ke komputer.

Perangkat kromatografi cair (sistem isokratik):

1 - kapasitas; 2 - sistem tekanan tinggi; 3 - injektor manual atau autosampler; 4 - kolom pemisah; 5 - detektor; b - pencatat atau komputer; 7 - tangki pembuangan; 8 - menyaring; 9 - filter masukan

Sistem yang ditunjukkan pada Gambar. 2 isokratik: komposisi fase gerak tidak berubah selama kromatografi. Jika selama analisis kromatografi perlu mengubah konsentrasi satu atau beberapa komponen fase gerak, maka yang disebut sistem gradien digunakan, biasanya terdiri dari dua atau lebih pompa. Dalam kasus elusi gradien, setiap pelarut diumpankan dari bejana terpisah ke dalam ruang pencampuran khusus dengan pengaduk magnet, di mana, menurut program tertentu, mereka dicampur dengan rasio volume tertentu.

Untuk analisis mikotoksin, sistem gradien sering digunakan, di mana larutan asetonitril dalam air dengan konsentrasi yang bervariasi secara linier dari waktu ke waktu digunakan sebagai fase gerak.

Kolom kromatografi adalah tabung logam dari 150 hingga 250 mm dengan diameter dalam 4,6 mm, diisi dengan sorben khusus berdasarkan silika gel dengan radikal hidrokarbon yang dicangkok. Kolom penjaga berfungsi untuk melindungi kolom kromatografi dari kontaminasi.

Detektor fotometrik UV adalah jenis detektor HPLC yang paling umum. Prinsip pengoperasian detektor mirip dengan prinsip pengoperasian spektrofotometer konvensional: ia merekam kerapatan optik suatu larutan. Perbedaannya adalah bahwa detektor UV adalah detektor aliran, alih-alih kuvet dengan larutan, ia menggunakan sel fotometrik. Aliran eluen mengalir melalui sel kerja dan fase gerak murni mengalir melalui sel referensi. Sumber cahaya adalah lampu merkuri yang memancarkan radiasi UV intens. Cahaya dengan panjang gelombang yang diinginkan dipancarkan menggunakan filter optik yang sesuai, melewati sel, sebagian diserap oleh molekul fase gerak dan komponen terpisah, dan ditangkap oleh fotodetektor. Penyerapan cahaya (densitas optik) dari eluat secara terus menerus direkam oleh perekam atau komputer, merekam kromatogram. Komponen campuran yang terpisah (misalnya, mikotoksin) disajikan dalam kromatogram sebagai puncak. Posisi puncak pada kromatogram digunakan untuk identifikasi zat, dan area puncak untuk kuantifikasi.

Perangkat yang lebih canggih adalah detektor fluoresensi (fluorometrik). Detektor ini memanfaatkan kemampuan senyawa organik, khususnya aflatoksin dan zearalenon, untuk berfluoresensi saat terkena sinar UV atau radiasi sinar tampak. Detektor fluoresensi memiliki sel aliran dengan dua saluran optik yang saling tegak lurus. Salah satunya berfungsi untuk memasok radiasi yang menarik, yang lain memungkinkan Anda untuk mengukur intensitas fluoresensi. Dalam kasus analisis aflatoksin B 1 dan M 1, panjang gelombang eksitasi adalah 360 nm dan panjang gelombang radiasi yang dipancarkan adalah 420 nm.

Perlu dicatat bahwa detektor UV juga dapat digunakan untuk analisis aflatoksin; namun sensitivitasnya jauh lebih rendah daripada detektor fluorometrik; oleh karena itu, ketika menganalisis aflatoksin konsentrasi rendah (pada tingkat MPC dan di bawahnya). ), deteksi fluoresensi lebih disukai.

D.M. Zubovsky, Institusi Negara "Pusat Kedokteran Hewan Negara Belarusia", kepala dokter hewan

Metode ini dikembangkan lebih lanjut dengan nama kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (HPTLC, HPTLC). Mengurangi ketebalan lapisan fase diam (hingga 100 mikron) dan ukuran partikel (hingga 5 mikron) menghasilkan pemisahan zat yang lebih baik dalam periode waktu yang lebih singkat.
Metode TLC tersedia untuk hampir semua mikotoksin. Deteksi dan identifikasi spesifik dirancang untuk setiap mikotoksin individu menggunakan sifat molekuler atau reaksi transformasi.

Kerugian utama dari kromatografi lapis tipis adalah:
produktivitas rendah;
Sebagian besar sampel memerlukan langkah ekstraksi dan pemurnian untuk menghilangkan potensi gangguan dan senyawa matriks sebelum analisis;
konsentrasi analit harus dalam kisaran 0,01-0,1%;
penggunaan racun dan bahan yang mudah menguap sebagai pelarut.
Metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) di bidang penelitian mikotoksin terutama digunakan untuk pemisahan akhir senyawa matriks dan deteksi analit yang diinginkan. Metode HPLC banyak digunakan saat ini karena kinerja dan keandalannya yang unggul dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis. Metode HPLC telah dikembangkan untuk sebagian besar mikotoksin utama dalam sereal dan produk pertanian lainnya. Sebagian besar metode dapat diandalkan dan stabil.
Metode HPLC didasarkan pada pemisahan ekstrak yang dianalisis dalam fase diam kolom kromatografi (Gambar 3) (kolom C8 dan C18 lebih sering digunakan untuk analisis mikotoksin) dan identifikasi lebih lanjut serta penentuan kuantitatifnya menggunakan detektor khusus. Detektor yang paling umum untuk analisis mikotoksin saat ini adalah ultraviolet dan fluorescent.
Batas sensitivitas metode HPLC yang menggunakan detektor ini dapat mencapai 1 g/kg sampel.
Pengembangan metode HPLC untuk analisis simultan dari beberapa mikotoksin telah dilaporkan dalam literatur. Mikotoksin trichothecene, khususnya trichothecenes, dianalisis dengan keberhasilan tertentu.

Dalam prakteknya, untuk studi pakan dan makanan di lapangan, kondisi produksi dan laboratorium pengujian, diperlukan metode yang memungkinkan penelitian kuantitatif dan cepat. jumlah besar sampel untuk keberadaan mikotoksin, jika memungkinkan dengan biaya usaha dan sumber daya keuangan yang paling rendah.
Semua karakteristik ini dipenuhi dengan metode berdasarkan reaksi imunologis. Metode imunologi yang tersedia secara komersial untuk analisis mikotoksin didasarkan pada penggunaan antibodi monoklonal dan poliklonal spesifik terhadap racun tertentu, dan umumnya dibagi menjadi:
metode berdasarkan kolom imunoafinitas (IAC, IAC);
uji imunosorben terkait-enzim (ELISA, ELISA) (tabel 1).

Biasanya, kolom imunoafinitas sebenarnya digunakan untuk menghilangkan senyawa matriks dari sampel dan memungkinkan isolasi dan konsentrasi mikotoksin tertentu.
Elusi toksin berikutnya dari IAC memungkinkan penentuan kuantitatif menggunakan metode analitik klasik. Dalam kasus immunoassay enzim, prosedur pembersihan biasanya tidak seintensif metode analisis lainnya. Ekstrak homogenat atau sampel yang mengandung mikotoksin diuji secara langsung secara kuantitatif menggunakan pelat mikrotiter standar atau uji tabung ELISA, atau uji membran imunosorben terkait-enzim digunakan untuk menentukan keberadaan mikotoksin secara kualitatif atau semi-kuantitatif.
Metode lain untuk mempelajari mikotoksin menggunakan pendekatan imunologi yang dilaporkan dalam literatur termasuk biosensor optik dan akustik, elektroforesis kapiler.

Kolom imunoafinitas biasanya digunakan untuk memurnikan sampel uji dari matriks kompleks dan konsentrasi racun sebelum mendeteksi dan menilai kandungan mikotoksin menggunakan sejumlah metode analitik klasik seperti HPLC, kromatografi gas, spektrometri massa, fluorometri, HPTLC, dan KLT. Metode ini terdiri dari menyuntikkan ekstrak sampel ke dalam kolom yang berisi matriks imunoafinitas yang mengandung fase padat (misalnya, manik-manik agarosa) di mana antibodi anti-mikotoksin terikat secara kovalen (Gambar 4). Molekul toksin yang terkandung dalam sampel mengikat antibodi amobil yang sesuai. Langkah selanjutnya meliputi penghilangan komponen matriks dan ekstraktan yang tidak terikat, elusi toksin dengan mengubah komposisi elusi, dan terakhir deteksi toksin menggunakan metode analisis. Sebagai alternatif, mikotoksin yang terikat pada kolom dapat dielusi dan diukur secara langsung dengan fluorometri berdasarkan fluoresensi intrinsik mikotoksin.
Tes membran memungkinkan untuk waktu yang singkat (sekitar 10-15 menit) untuk memberikan jawaban atas pertanyaan: apakah mikotoksin hadir dalam sampel uji di atas batas sensitivitas tes ini? Artinya, sebenarnya, ini adalah penentuan kualitatif ada / tidaknya mikotoksin dalam sampel. Metode ini membutuhkan ekstraksi, filtrasi, pemurnian (melalui kolom) dan pengenceran sampel. Selanjutnya, larutan tersebut diaplikasikan pada membran yang peka dengan antibodi monoklonal, yang juga ditambahkan konjugat enzim mikotoksin. Jika konsentrasi mikotoksin dalam sampel melebihi batas deteksi tes, semua antibodi di permukaan mengikatnya dan semua konjugat yang ditambahkan dihilangkan selama langkah pencucian. Ketika substrat tidak berwarna ditambahkan, konjugat mengkatalisis reaksi warna pada permukaan membran, akibatnya bintik berwarna terbentuk di situs pengikatan konjugasi. Pewarnaan zona analitis membran menunjukkan tidak adanya mikotoksin dalam sampel.
Uji imunosorben terkait-enzim biasanya digunakan untuk memantau keberadaan mikotoksin di atas tingkat tertentu (atau kekurangannya) dalam sampel uji. Sejumlah metode kualitatif, semi-kuantitatif dan kuantitatif saat ini tersedia. Berdasarkan hasil ELISA, sampel yang mencurigakan harus diperiksa ulang menggunakan metode klasik. Tersedia pilihan yang berbeda ELISA untuk analisis mikotoksin (misalnya uji membran, pelat mikrotiter, dan metode tabung). Biasanya, ELISA didasarkan pada uji pesaing yang menggunakan mikotoksin terkonjugasi enzim atau antibodi terhadap toksin tertentu yang diinginkan (Gambar 5). Urutan reaksi yang khas menggunakan reagen siap pakai dalam format pelat mikrotiter adalah sebagai berikut:
1. konjugat enzimatik ditambahkan ke ekstrak sampel uji;
2. campuran ditambahkan ke antibodi yang sesuai yang diterapkan pada permukaan lubang pelat (misalnya, pelat mikrotiter, dilapisi dengan antibodi);
3. jumlah konjugat yang terikat pada toksin yang diikat oleh antibodi amobil tergantung pada jumlah toksin dalam sampel; semakin tinggi jumlah toksin dalam sampel, semakin rendah jumlah konjugat enzim yang melekat pada antibodi yang diterapkan pada permukaan sumur pelat dan sebaliknya;
4. Aktivitas enzimatik konjugat yang terikat pada antibodi permukaan ditentukan dengan penambahan substrat yang sesuai, yang mengarah pada pembentukan produk berwarna, konsentrasinya berbanding terbalik dengan konsentrasi toksin dalam sampel uji.

Berdasarkan Pusat Kedokteran Hewan Negara Belarusia, selama 2004-2006 kami analisis kandungan mikotoksin dalam pakan dilakukan dengan menggunakan uji imunosorben terkait-enzim. Untuk penelitian ini, kami menggunakan sistem uji siap pakai yang diproduksi oleh R-Biopharm, Jerman. Perusahaan ini memproduksi sejumlah kit untuk penentuan kuantitatif mikotoksin: aflatoksin B, G, M, zearalenone, ochratoxin A, T-2 toxin, deoxynivalenol, fumonisin B1, citrinin. Perlu dicatat bahwa untuk hampir semua mikotoksin yang terdaftar, ada sistem uji untuk penentuan konsentrasi rendah senyawa beracun ini dengan batas sensitivitas pada tingkat metode kromatografi (RIDASCREEN® Mycotoxins) (waktu inkubasi 1-2 jam ) dan metode ekspres yang memungkinkan untuk menentukan secara praktis konsentrasi yang sama selama 15-30 menit (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Semua metode telah disetujui di Republik Belarus dan dapat digunakan di laboratorium yang merupakan bagian dari struktur Kementerian. Pertanian dan makanan.
Organisasi analisis mikotoksin dalam pakan dan makanan dengan metode enzim immunoassay dimungkinkan dengan cara minimal dan paling banyak waktu singkat... Kemudahan pengoperasian dan biaya rendah dari peralatan yang diperlukan membedakan enzim immunoassay dari metode analisis klasik (Tabel 2, 3) dan membuatnya sangat menarik untuk laboratorium dengan sumber daya keuangan yang terbatas.
Perlu dicatat bahwa dengan indikator batas deteksi yang hampir sama, metode uji imunosorben terkait-enzim lebih produktif dan memungkinkan studi selektif hanya sampel yang dicurigai oleh ELISA dengan metode instrumental. Misalnya, dengan menggunakan metode ELISA, satu asisten laboratorium dapat menganalisis 10-100 sampel dalam satu shift kerja, sedangkan menggunakan HPLC hanya 1-10 sampel. Dalam hal ini, enzim immunoassay membutuhkan waktu dari 15 menit hingga 3 jam (preparasi sampel hingga 1 jam), dan dengan HPLC - 2-4 jam dengan persiapan sampel 1-3 hari.

Kesimpulan. Melakukan penelitian untuk mengidentifikasi kontaminasi pakan dengan mikotoksin selama periode ini memungkinkan untuk mendiagnosis wabah penyakit yang tiba-tiba di beberapa peternakan republik, yang memungkinkan untuk menerapkan langkah-langkah yang memadai dan dengan demikian mengurangi kerugian ekonomi produsen.
Biaya studi tepat waktu pakan produksi kita sendiri, dan terlebih lagi dibeli di negara lain, akan selalu lebih rendah daripada biaya melakukan diagnosa darurat wabah penyakit, mengambil tindakan yang diperlukan untuk penggunaan atau pembuangan pakan yang terkontaminasi, serta kerugian dari penurunan produktivitas dan kematian hewan.

Literatur:
1. Bioaerosol: Penilaian dan Pengendalian, 24.1.3. - ACGIH, Cincinnati, OH 1999.
2. Standar kedokteran hewan dan sanitasi untuk keamanan pakan dan aditif pakan:: No. 48: disetujui. Kementerian Pertanian dan Pangan Republik Belarus dari 28.04.08: masukan. efektif 28.04.08.
3. Jaringan Informasi Mikotoksikologi Eropa. - http://www.mycotoxins.org
4. Peraturan Komisi Uni Eropa No. 466/2001 tanggal 8 Maret 2001 “Menetapkan tingkat maksimum yang diperbolehkan untuk kontaminan tertentu dalam makanan”. - OJ L 77, 16.3.2001. - P. 1.

Mikotoksin dan metode penentuannya

Mikotoksin (dari bahasa Yunani mykes - jamur dan toksikon - racun) adalah metabolit sekunder dari jamur mikroskopis dengan sifat toksik yang nyata. Bahaya tinggi mikotoksin diekspresikan dalam kenyataan bahwa mereka memiliki efek toksik dalam jumlah yang sangat kecil dan mampu berdifusi secara intensif ke kedalaman produk.

Aflatoksin adalah anggota kelompok mikotoksin yang paling berbahaya dengan hepatotoksin yang kuat dan sifat karsinogenik. Aflatoksin diproduksi oleh strain yang berbeda dari hanya dua spesies Aspergillus (Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus), yang tersebar luas di seluruh dunia. Perlu dicatat bahwa jamur toksigenik dapat menginfeksi substrat tanaman tidak hanya selama penyimpanan, tetapi juga selama pertumbuhan, panen, transportasi, dan pemrosesan.

Keluarga aflatoksin mencakup empat perwakilan utama (aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2), serta lebih dari 10 senyawa yang merupakan turunan atau metabolit dari kelompok utama (M 1, M 2, B 2a, G 2a , GM 1, P 1, Q 1, dll.).

V kondisi alam Aflatoksin ditemukan lebih sering dan dalam jumlah terbesar dalam kacang tanah, jagung, dan biji kapas. Selain itu, mereka dapat terakumulasi dalam jumlah yang signifikan di berbagai kacang, biji minyak, gandum, jelai, kakao dan kopi, serta dalam pakan ternak.

Perlu dicatat kemungkinan munculnya aflatoksin dalam produk asal hewan: dalam susu, jaringan dan organ hewan yang menerima pakan yang terkontaminasi aflatoksin dalam konsentrasi tinggi.

Telah terbukti bahwa sapi mengeluarkan dengan susu dari 0,35 hingga 2-3% aflatoksin B 1 yang diperoleh dengan pakan dalam bentuk metabolit yang sangat beracun - aflatoksin M 1 Pada saat yang sama, pasteurisasi susu dan proses pengeringan tidak signifikan. mempengaruhi kandungan aflatoksin M 1 di dalamnya. Aflatoksin M1 telah ditemukan baik pada susu utuh maupun susu kering bahkan pada produk susu yang telah mengalami proses teknologi (pasteurisasi, sterilisasi, pembuatan keju cottage, yoghurt, keju, dll). Jadi, dalam proses memperoleh keju dari susu yang terkontaminasi, 50% aflatoksin M1 ditentukan dalam massa dadih. Setelah menerima mentega, 10% aflatoksin M 1 menjadi krim, 75% tetap dalam susu skim.

Aflatoksin kurang larut dalam air, tidak larut dalam pelarut non-polar, tetapi mudah larut dalam pelarut polaritas menengah seperti kloroform, metanol, dan dimetil sulfoksida. Mereka cukup tidak stabil dalam bentuk kimia murni dan sensitif terhadap efek udara dan cahaya.

Aflatoksin praktis tidak dihancurkan selama ekskresi kuliner biasa dari produk makanan yang terkontaminasi.

Mikotoksin Trichothecene adalah metabolit sekunder dari jamur mikroskopis dari genus Fusarium, yang menginfeksi pakan dan produk makanan, akibatnya toksikosis pencernaan terjadi pada hewan dan manusia. Mereka paling sering ditemukan dalam biji-bijian jagung, gandum dan barley. Mikotoksin dari kelompok ini ada di mana-mana, terutama di negara-negara dengan iklim kontinental sedang. Tidak jarang dua atau lebih mikotoksin ditemukan dalam produk yang sama. Saat melakukan sertifikasi wajib, kontrol atas konten dua perwakilan kelompok ini disediakan, yaitu deoxynivalenol dan toksin T-2 yang distandarisasi.

Deoksinivalenol(DON), salah satu fusariotoxins yang paling umum, menghambat sintesis protein, mengurangi konsentrasi ytgunogaobulin dalam serum darah, dan dapat menekan sistem reproduksi. Kontaminasi pakan ternak sangat berbahaya. Dengan demikian, DON menginduksi muntah pada hewan, mengurangi asupan pakan pada anak babi. toksin T-2 kurang luas tetapi lebih beracun daripada DON. Toksin T-2 menyebabkan iritasi, perdarahan dan nekrosis pada saluran pencernaan. Keracunan akut dengan trichothecenes disertai dengan kerusakan pada organ hematopoietik dan kekebalan tubuh. Ditandai dengan perkembangan sindrom hemoragik, penolakan makan, muntah.

Zearalenone dan turunannya juga diproduksi oleh jamur mikroskopis dari genus Fusarium. Substrat alami utama di mana Zearalenone paling sering ditemukan adalah jagung. Jamur dari genus Fusariurn graminearum sering menyerang jagung di lahan tegakan dan menyebabkan jagung dan busuk batang. Jagung juga dapat terkontaminasi Zearalenone selama penyimpanan. Tingkat deteksi zearalenone tinggi dalam pakan campuran, serta gandum, barley dan gandum. Di antara makanan, racun ini telah ditemukan di tepung jagung, sereal dan bir jagung.

Zearalenone memiliki efek estrogenik dan teratogenik yang nyata dan merupakan masalah serius bagi peternakan di banyak negara, dan kemampuan mikotoksin ini untuk terakumulasi dalam jaringan hewan ternak membuatnya berpotensi berbahaya bagi kesehatan manusia. Kontaminasi Zearalenon pada pakan menyebabkan penurunan fertilitas, abortus, infertilitas dan penyakit inflamasi pada babi, sapi, unggas dan kelinci. Meskipun demikian, sampai saat ini, beberapa turunan zearalenone digunakan sebagai stimulan pertumbuhan pada hewan dan banyak diproduksi oleh industri.

Patulin adalah mikotoksin yang sangat berbahaya dengan sifat karsinogenik dan mutagenik. Produsen utama patulin adalah jamur mikroskopis Penicillium patulum dan Penicillium expansum. Produsen patulin terutama mempengaruhi buah-buahan dan beberapa sayuran, menyebabkan mereka membusuk. Patulin ditemukan dalam apel, pir, aprikot, persik, ceri, anggur, pisang, stroberi, blueberry, lingonberry, buckthorn laut, quince, dan tomat. Apel paling sering terkena patulin, dimana kandungan toksinnya bisa mencapai 17,5 mg/kg. Patulin tidak hanya ditemukan di bagian busuk buah dan sayuran, tetapi juga di bagian normal. Misalnya, pada tomat, patulin didistribusikan secara merata ke seluruh jaringan.

Patulin juga ditemukan dalam konsentrasi tinggi dalam buah dan sayuran olahan: jus, kolak, mope, dan selai. Ini terutama sering ditemukan dalam jus apel (0,02-0,4 mg / l). Kandungan patulin dalam jenis jus lainnya: pir, quince, anggur, prem, mangga - berkisar 0,005 hingga 4,5 mg / l.

Kontrol atas kandungan mikotoksin adalah wajib ketika mensertifikasi bahan baku makanan dan produk makanan. Di Rusia, standar sanitasi dan higienis telah diadopsi untuk kandungan mikotoksin dalam makanan, yang diberikan dalam tabel. 12.

Sistem tindakan untuk pencegahan mikotoksikosis meliputi analisis sanitasi dan mikologi produk makanan (Gbr. 13).

Tabel 12. Kadar mikotoksin yang diperbolehkan pada kelompok makanan tertentu

Selain itu, banyak perhatian diberikan untuk menemukan cara dekontaminasi dan detoksifikasi bahan mentah dan produk makanan yang terkontaminasi mikotoksin. Untuk tujuan ini, metode mekanis, fisik dan kimia digunakan:

1) mekanis- pemisahan bahan yang terkontaminasi secara manual atau menggunakan penyortir kalorimetri elektronik;

2) fisik perlakuan panas, paparan radiasi ultraviolet;

3) bahan kimia- pengobatan dengan larutan zat pengoksidasi, asam kuat dan basa.

Namun, penggunaan metode pemurnian mekanis dan fisik tidak memberikan efek yang tinggi, metode kimia menyebabkan penghancuran tidak hanya mikotoksin, tetapi juga nutrisi yang bermanfaat, serta mengganggu penyerapannya.

Beras. 12.Analisis sanitasi dan mikrobiologis produk makanan

14.8.1 Metode untuk penentuan mikotoksin

Metode modern untuk deteksi dan penentuan mikotoksin dalam makanan dan pakan meliputi metode penyaringan, metode analisis kuantitatif dan metode biologis.

Metode pembuatan skrip cepat dan nyaman untuk analisis serial, memungkinkan Anda dengan cepat dan andal memisahkan sampel yang terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Metode penyaringan meliputi kromatografi lapis tipis (metode KLT), metode fluoresensi untuk penentuan butir yang terkontaminasi aflatoksin.

Metode analisis kuantitatif untuk penentuan mikotoksin disajikan dengan metode kimia, radioimunologi dan imunoenzim. Saat ini, yang paling umum adalah metode kimia, yang meliputi dua tahap: tahap isolasi dan tahap penentuan kuantitatif mikotoksin. Tahap isolasi meliputi ekstraksi (pemisahan mikotoksin dari substrat) dan pemurnian (pemisahan mikotoksin dari senyawa yang memiliki sifat fisikokimia yang mirip). Pemisahan akhir dan kuantifikasi mikotoksin dilakukan dengan menggunakan berbagai metode kromatografi. Metode universal untuk penentuan semua jenis mikotoksin adalah kromatografi lapis tipis (KLT).

dalam biji-bijian kacang individu, isinya dapat berkisar dari seperseribu miligram hingga puluhan miligram atau lebih per 1 kg, yaitu, berbeda 5-6 kali lipat. Untuk alasan ini, kontribusi kesalahan pengambilan sampel terhadap kesalahan analisis total dalam penentuan aflatoksin dalam kacang tanah adalah yang utama dan dalam beberapa kasus bisa lebih dari 90%.

Dari sudut pandang keseragaman kontaminasi mikotoksin, berat produk dapat dibagi menjadi dua kelompok: 1) produk dengan tingkat heterogenitas yang tinggi (kacang yang dikupas dan tidak dikupas, biji minyak, biji-bijian utuh atau kasar, kacang); 2) produk dengan karakter kontaminasi yang homogen (cairan: susu, minyak sayur, jus, pantai; tepung, tepung giling).

Untuk mendapatkan sampel rata-rata yang representatif dari produk Kelompok 1, ukuran sampel awal harus sebesar mungkin (minimal 2 kg), sedangkan sampel laboratorium rata-rata harus diisolasi dari sampel rata-rata yang digiling (dihomogenisasi).

Untuk produk homogen dari kelompok ke-2 (selai, selai, jus buah dalam wadah kaleng kecil, susu kental, produk susu kering, dll.), sampel harus diambil dalam jumlah unit pengemasan yang sesuai dengan ukuran sampel rata-rata (100 -200 g), asalkan produk berasal dari batch yang sama.

Tidak seperti aflatoksin, trichothecenes tidak menunjukkan penyerapan atau fluoresensi di bagian spektrum yang terlihat, yang mempersulit deteksi mereka dengan kromatografi lapis tipis. Namun, adalah mungkin untuk mendeteksi trikothesen dengan KLT menggunakan metode yang didasarkan pada pemrosesan pelat KLT dengan reagen khusus yang membentuk turunan berwarna atau fluoresen dengan trikotesen. Misalnya, toksin T-2, ketika diolah dengan asam sulfat pekat, membentuk bintik-bintik dengan fluoresensi biru dalam sinar UV.

Metode arbitrase untuk penentuan kuantitatif mikotoksin adalah sebagai berikut:

Kromatografi gas-cair (untuk toksin T-2);

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan detektor fotomustrik UV (untuk deoxynivalenol dan patulin);

HPLC menggunakan detektor fluoresensi (untuk aflatoxips dan zearalenone).

Untuk analisis mikotoksin, sistem HPLC gradien sering digunakan, di mana larutan asetonitril dalam air dengan konsentrasi yang bervariasi secara linier dari waktu ke waktu digunakan sebagai fase gerak.

Kolom kromatografi adalah tabung logam dengan panjang 150 hingga 250 mm dengan diameter dalam 4,6 mm, diisi dengan sorben khusus berdasarkan silika gel dengan radikal hidrokarbon yang dicangkok. Kolom penjaga berfungsi untuk melindungi kolom kromatografi dari kontaminasi.

Detektor fotomeorik UV adalah jenis detektor HPLC yang paling umum. Prinsip pengoperasian detektor mirip dengan prinsip pengoperasian fotometer spektral konvensional: ia merekam kerapatan optik suatu larutan. Perbedaannya adalah bahwa detektor UV adalah detektor aliran, alih-alih kuvet dengan larutan, ia menggunakan sel fotometrik. Aliran eluen mengalir melalui sel kerja, dan aliran fase gerak murni diarahkan melalui sel referensi. Sumber cahaya adalah lampu merkuri yang memancarkan radiasi UV intens. Cahaya dengan panjang gelombang yang diinginkan dipancarkan menggunakan filter optik yang sesuai, melewati sel, sebagian diserap oleh molekul fase gerak dan komponen terpisah, dan ditangkap oleh fotodetektor. Penyerapan cahaya (densitas optik) dari eluat secara terus menerus direkam oleh perekam atau komputer, merekam kromatogram. Komponen campuran yang terpisah (misalnya, mikotoksin) disajikan dalam kromatogram sebagai puncak. Posisi puncak pada kromatogram digunakan untuk identifikasi zat, dan area puncak untuk kuantifikasi.

Perlu dicatat bahwa detektor UV juga dapat digunakan untuk analisis aflatoksin, tetapi sensitivitasnya jauh lebih rendah daripada detektor fluorometrik; oleh karena itu, ketika menganalisis aflatoksin konsentrasi rendah (pada level MPC dan di bawahnya) , deteksi fluoresensi lebih disukai.

Metode yang cepat, aman dan ekonomis untuk penentuan mikotoksin dalam produk asal hewan dan tumbuhan diusulkan. Penentuan dilakukan dari sampel 2 g, ekstrak yang dimurnikan menurut QuEChERS dibagi menjadi tiga bagian, masing-masing 2 ml, dan 300 l kloroform digunakan sebagai dispersan dalam mikroekstraksi cair-cair dispersif. Ekstrak yang diperoleh dimasukkan ke dalam mikroflakon, pelarut diuapkan dan residu pada mikroflakon pertama dan ketiga dilarutkan dalam 50 l asetonitril, pada mikroflakon kedua dalam 50 l heksana. Dalam mikroflakon pertama, aflatoksin (B1, B2, G1, G2), zearalenone dan ochratoxin A ditentukan oleh HPLC dengan detektor fluorometrik; acetyldeoxynivalenol), patulin, ochratoxin A dan zearalenone dengan kromatografi gas-cair dengan detektor penangkapan elektron, di yang ketiga - patulin dan zearalenone oleh HPLC dengan detektor dioda-array. Durasi penentuan mikotoksin adalah 1,5-2 jam dengan pengerjaan simultan pada 3 kromatografi. Persiapan sampel membutuhkan 10,1 ml asetonitril, 0,9 ml kloroform, dan 0,05 ml heksana. Penggunaan opsi kromatografi yang berbeda untuk penentuan patulin, zearalenone, ochratoxin A menghasilkan hasil analisis yang lebih andal. 1 sdm, 1 mantan

Invensi ini berkaitan dengan industri makanan dan pengolahan dan dapat digunakan untuk menentukan kandungan mikotoksin dalam produk makanan, sereal, pakan dan daging untuk menilai keamanannya.

Metode untuk penentuan semua mikotoksin standar dari satu sampel belum diusulkan saat ini. Metode untuk penentuan mikotoksin individu atau kelas individu diketahui.

Jadi, untuk menentukan zearalenone, T-2, ochratoxin A, kromatografi lapis tipis digunakan untuk setiap toksin secara terpisah (GOST 28001-88. Metode penentuan mikotoksin T-2, zearalenone dan ochratoxin A. Pakan biji-bijian, produk olahannya , pakan campuran). Metode ini sangat kompleks, memakan waktu dan memungkinkan penentuan semi-kuantitatif mikotoksin yang ditunjukkan dari masing-masing sampel terpisah.

Metode yang dikenal untuk penentuan aflatoksin (B1, B2, G1, G2) dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi fluorometri (GOST R 53162-2008. Produk makanan. Penentuan aflatoksin B1 dan kandungan total aflatoksin B1, B2, G1 , G2). Aflatoksin diekstraksi dengan metanol, ekstrak dimurnikan dan dipekatkan pada kolom imunoafinitas, dielusi dengan metanol, diuapkan hingga volume kecil dan dikromatografi. Teknik ini memakan waktu, mahal dan membutuhkan aplikasi. jumlah yang besar pelarut.

Metode yang dikenal untuk penentuan deoxynivalenol (GOST R 51116-97. Pakan majemuk, biji-bijian, produk pengolahannya. Metode untuk menentukan kandungan deoxynivalenol), berdasarkan ekstraksi mikotoksin dari sampel dengan asetonitril, pemurnian ekstrak pada dua kolom berturut-turut dengan batubara, elusi deoxynivalenol dengan asetonitril, sampai volume penguapan dan analisis dengan kromatografi cair dengan detektor UV. Namun, metode yang diusulkan memakan waktu, melelahkan dan tidak memungkinkan penentuan semua mikotoksin secara simultan.

Metode yang dikenal untuk penentuan patulin (Paten RF No. 2056044, G01N 33/02. Metode untuk penentuan kuantitatif patulin dalam makanan), berdasarkan ekstraksi patulin dari sampel dengan etil asetat, pemurnian ekstrak pada adsorben, konsentrasi ekstrak dan analisis dengan kromatografi cair. Teknik ini panjang dan membutuhkan penggunaan sejumlah besar pelarut.

Sebuah metode yang dikenal untuk penentuan simultan mikotoksin trichothecene dan zearalenone dalam biji-bijian dengan kromatografi gas-spektrometri massa (Toshitsuga Tanaka at al. Penentuan simultan mikotoksin trichothecene dan zearalenone dalam sereal dengan kromatografi gas-spektrometri massa / J. Chromatogr. A. 2000. 882. .23-28). Esensinya terletak pada ekstraksi mikotoksin dari 10 g sampel 100 ml asetonitril selama 30 menit, penghilangan lemak dengan ekstraksi dengan 20 ml heksana, penguapan ekstrak asetonitril hingga kering, pembubaran residu kering dalam campuran metanol dengan kloroform, pemurnian ekstrak pada kolom dengan Florisil, penguapan ekstrak sampai kering, melarutkan residu dalam 2 ml metanol, derivatisasi dengan tetrametilsilane dan kemudian kromatografi. Metode ini memakan waktu, padat karya dan mahal.

Ada metode yang dikenal untuk penentuan simultan aflatoksin, okratoksin A dan zearalenon dalam biji-bijian dengan kromatografi kinerja tinggi dengan detektor fluorometrik (Gobel R., Lusky K. Penentuan aflatoksin, okratoksin A, dan zearalenon dalam biji-bijian secara simultan oleh kolom imunoafinitas baru / kromatografi kimia cair / Kontaminan Makanan 2004. V.87. No. 2. P.411-418). Esensinya adalah mengekstrak mikotoksin dari 25 g sampel 100 ml larutan asetonitril, memurnikan ekstrak pada kolom imunoafinitas, mengekstrak 2 ml metanol dari kolom mikotoksin, menguapkan ekstrak hingga kering, melarutkan residu dalam heksana, menurunkan residu dengan asam trifluoroasetat hingga kering selama 15 menit, menguapkan residu dengan asam trifluoroasetat hingga mengeringkan metanol dan penentuan mikotoksin pada panjang gelombang yang berbeda (aflatoksin - 360-440 nm, zearalenon - 276-466 nm dan okratoksin A - 330-460 nm) . Metode ini memakan waktu dan melelahkan, dan membutuhkan sejumlah besar pelarut.

Yang paling dekat dengan metode yang diusulkan adalah metode untuk penentuan simultan aflatoksin dalam produk sereal (Campone L., Piccinelli AL, Cetano R., Rastrelli L. Penerapan dispersif cair-cair mikroekstraksi untuk penentuan aflatoksin B1, B2, G1, G2 dalam produk sereal / J Chromatogr.A. 2011 1248 P.7548-7554). Esensinya adalah mengekstrak mikotoksin dari 25 g sampel 100 ml larutan metanol, menghilangkan lemak dengan ekstraksi dengan 6 ml heksana, memurnikan 1 ml ekstrak menggunakan mikroekstraksi cair-cair dispersif dengan kloroform (220 l), menghilangkan kloroform, melarutkan residu dalam 0,1 ml metanol dan penentuan aflatoksin oleh PELC dengan detektor fluorometrik. Faktor konsentrasi mikotoksin adalah 2,0-2,5. Namun, metode ini memakan waktu, membutuhkan sejumlah besar pelarut, koefisien konsentrasi rendah dan tidak memungkinkan penentuan mikotoksin lain dari ekstrak yang sama. Durasi analisis aflatoksin hanya 1,5-2 jam.

Tujuan dari penemuan ini adalah untuk mengurangi durasi analisis, untuk meningkatkan reproduktifitas dan keandalan hasil analisis, untuk mengurangi konsumsi pelarut organik dan untuk memastikan keselamatan operator.

Tujuan ini dicapai dengan fakta bahwa menurut metode untuk penentuan mikotoksin, termasuk pengambilan sampel, ekstraksi mikotoksin dengan asetonitril dengan adanya agen penggaraman, pemurnian ekstrak dengan sorben curah (metode persiapan sampel menurut QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck FJ // J. AOAC Int. 2003. V.86. No. 2. P.412), sentrifugasi dan penentuan dengan metode kromatografi. Pada metode yang diusulkan, ekstraksi dilakukan dari 2 g sampel, ekstrak yang dimurnikan dibagi menjadi tiga bagian masing-masing 2 ml dan digunakan sebagai dispersan dalam ekstraksi mikro cair-cair dispersif dengan penambahan bagian pertama (untuk penentuan aflatoksin, okratoksin A dan zearalenon) 300 l kloroform yang mengandung 0,05% yodium, ke detik (untuk penentuan mikotoksin trikotosen, patulin, zearalenone, okratoksin A) - 300 l kloroform yang mengandung 50 l trifluoroasetat anhidrida, ke ketiga (untuk penentuan patulin dan zearalenone) - 300 l kloroform, kemudian campuran yang dihasilkan disuntikkan masing-masing secara terpisah menggunakan jarum suntik dalam 5 ml air dalam tabung sentrifus berkapasitas 15 ml dengan dasar kerucut, diinkubasi selama 30 s dalam rendaman ultrasonik, disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit, lapisan bawah ekstrak dimasukkan ke dalam mikrofakon, pelarut dibersihkan dengan nitrogen dan residu dalam mikrovial pertama dan ketiga dilarutkan dalam 50 l asetonitril, dalam kedua - dalam 50 l heksana, dalam m . pertama Icroflacone menentukan aflatoksin (B1, B2, G1, G2), okratoksin A dan zearalenon oleh HPLC dengan detektor fluorometrik, di kedua - mikotoksin trikotosen (deoxynivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooxyskirpenelenol, 13- dan patulin, zearalenone, ochratoxin A) dengan kromatografi gas-cair dengan detektor penangkapan elektron, yang ketiga - patulin dan zearalenone oleh HPLC dengan detektor dioda-array.

Contoh penentuan mikotoksin. Masukkan 2.000 g produk yang dihancurkan (biji-bijian, pakan, daging) ke dalam tabung reaksi dengan kapasitas 50 ml, tambahkan 10 ml asetonitril dan 10 ml air, kocok kuat-kuat selama 5 menit, tuangkan campuran garam (4 g garam). magnesium sulfat, 1 g natrium klorida, 1 g natrium sitrat monohidrat dan 0,5 g natrium sitrat 1,5 air), tutup dan kocok kuat-kuat selama 1-2 menit, kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 3000 rpm. Ambil 8 ml ekstrak yang diperoleh ke dalam tabung reaksi 15 ml yang berisi 0,9 g magnesium sulfat, 0,2 g sorben Bondesil PSA dan C18, kocok kuat-kuat selama 1-2 menit, kemudian sentrifus selama 5 menit pada 3000 rpm.

Dalam tiga tabung reaksi, diambil 2 ml ekstrak yang diperoleh. Yang pertama, 300 l kloroform yang mengandung 0,05% yodium ditambahkan, yang kedua - 300 l kloroform yang mengandung 50 l trifluoroacetic anhydride, di yang ketiga - 300 l kloroform, kemudian campuran yang dihasilkan masing-masing disuntikkan secara terpisah menggunakan jarum suntik ke dalam 5 ml air dalam tabung centrifuge berbentuk kerucut, diinkubasi selama 30 detik dalam penangas ultrasonik dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit, lapisan bawah ekstrak dimasukkan ke dalam mikroflakon, pelarut dibersihkan dengan nitrogen, dan residu di mikroflakon pertama dan ketiga dilarutkan dalam 50 l asetonitril, yang kedua - dalam 50 l heksana.

Pada mikroflakon pertama, aflatoksin (B1, B2, G1, G2), okratoksin A dan zearalenon ditentukan dengan HPLC dengan detektor fluorometri. Kondisi kromatografi: kolom "Kromasil C18", 150 mm, fase gerak asetonitril / air (30/70), volume sampel 10 l, panjang gelombang eksitasi 340 nm, deteksi 450 nm untuk aflatoksin, 330-460 nm untuk okratoksin A dan 276-460 untuk Zearalenon.

Yang kedua, mikotoksin trichotosen (deoxynivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooxysirpetol, 13-acetyldeoxynivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol), zearalenone, patulin, ochratoxin A dengan kromatografi gas-cair dengan detektor. Kondisi kromatografi: kolom kapiler "OPTIMA ® - 5 - Aksen" (Macherey - Nagel, Jerman, 30 m), suhu termostat kolom 120 ° , suhu evaporator 200 ° , detektor 300 ° . Suhu termostat kolom adalah 120-310 ° C (laju pemanasan 15 derajat / menit), gas pembawa adalah nitrogen, volume sampel yang disuntikkan adalah 1 L tanpa pembagian aliran.

Di ketiga - patulin dan zearalenone oleh HPLC dengan deteksi dioda-array. Kondisi kromatografi: kolom kromatografi "XTerra RP18", 150 mm, fase gerak - asetonitril / air (gradien 4-80% asetonitril), laju umpan fase gerak 1 ml / menit, volume sampel yang disuntikkan 10 l, deteksi pada panjang gelombang analitik 236 dan 270nm.

Karakteristik metrologi utama dari penentuan mikotoksin dalam kondisi optimal menurut metode ini dengan penambahan standar mikotoksin yang diperkenalkan pada biji-bijian, daging dan pakan pada tiga tingkat konsentrasi ditunjukkan pada tabel.

Durasi penentuan mikotoksin yang ditunjukkan pada tabel adalah 1,5-2 jam dengan operasi simultan pada 3 kromatografi. Persiapan sampel membutuhkan 10,1 ml asetonitril, 0,9 ml kloroform, dan 0,05 ml heksana. Koefisien konsentrasi kira-kira 3 kali lebih tinggi daripada di prototipe, yang mengarah ke penentuan mikotoksin ini lebih sensitif. Penggunaan opsi kromatografi yang berbeda untuk penentuan patulin, zearalenone, ochratoxin A menghasilkan hasil analisis yang lebih andal.

meja
Karakteristik metrologi dasar untuk penentuan mikotoksin
	Waktu retensi, t R, min	Kisaran konten yang ditentukan, mg / kg		Faktor konsentrasi, K
mikotoksin			Diperkenalkan, mg / kg		Tingkat pemulihan, R,%

DALAM 1	24,2	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	100-109
DALAM 2	10,3	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,2-7,8	88-91
G1	20,6	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	98-100
G2	8,2	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005:0,001	7,6-7,8	86-98
T-2	19,7	0,01-3	0,01; 1,0; 2,0	6,1-7,3	80-90
NT-2	18,1	0,003-0,3	0,005;0,01;0,1	6,4-6,9	82-83
MENGENAKAN	14,2	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	7,6-8,9	98-100
zona	18,7	0,01-2	0,01: 1,0; 2,0	6,8-7,5	87-94
3-ADON	16,5	0,01-2	0,01:1,0:2,0	6,8-7,5	89-97
15-ADON	15,7	0,01-2	0,005:0,01:0,1	6,1-7,7	87-88
Nivalenol	14,3	0,003-0,3	0,005:0,01:0,1	6,4-7,5	85-97
Dasa	16,7	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	6,0-7,3	76-98
OTA	11,4	0,002-0,2	0,005:0,01:0,1	6,5-7,7	87-96
Patulin	7,1	0,01-2	0,01; 1,0: 2,0	6,8-7,8	89-96
DON - deoxynivalenol, ZON - zearalenone, 13, 15-ADON - acetyldeoxynivalenol, DAS - diacetooxysirpenol, OTA - ochratoxin A

MENGEKLAIM

Sebuah metode untuk penentuan mikotoksin dalam produk hewan dan tumbuhan, termasuk pengambilan sampel, ekstraksi mikotoksin dengan asetonitril dengan adanya agen penggaraman, pemurnian ekstrak dengan sorben curah (metode persiapan sampel menurut QuEChERS), sentrifugasi dan penentuan dengan metode kromatografi, dicirikan bahwa ekstraksi mikotoksin dilakukan dari 2 g sampel, ekstrak yang dimurnikan dibagi menjadi tiga bagian, masing-masing 2 ml dan digunakan sebagai dispersan dalam mikroekstraksi cair-cair dispersif dengan penambahan 300 l kloroform yang mengandung 0,05% yodium ke bagian pertama (untuk penentuan aflatoksin, zearalenon dan okratoksin A), penentuan mikotoksin trikotosen, patulin, zearalenone, okratoksin A) - 300 l kloroform yang mengandung 50 l trifluoroasetat anhidrida, ke ketiga (untuk penentuan patulin dan zearalenone) - 300 l kloroform, kemudian campuran yang dihasilkan disuntikkan masing-masing secara terpisah menggunakan jarum suntik dalam 5 ml air, yang terletak di centrifuge tag dengan kapasitas 15 ml dengan dasar kerucut, diinkubasi selama 30 detik dalam penangas ultrasonik, disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit, lapisan bawah ekstrak dimasukkan ke dalam mikroflakon, pelarut dibersihkan dengan nitrogen dan residu dalam mikroflakon pertama dan ketiga dilarutkan dalam 50 l asetonitril, yang kedua - dalam 50 l heksana, dalam mikroflakon pertama, aflatoksin (B1, B2, G1, G2), zearalenone dan okratoksin A ditentukan oleh HPLC dengan fluorimetri detektor, dalam mikotoksin trikotosen kedua (deoxynivalenol, nivalenol, NT-2, Tox-2, diacetol , 13-, 15-acetyldeoxynivalenol), patulin, ochratoxin A dan zearalenone dengan kromatografi gas-cair dengan detektor penangkapan elektron, di ketiga - patulin dan zearalenone oleh HPLC dengan detektor dioda-array.

Metode untuk penentuan mikotoksin

Metode modern untuk mendeteksi dan menentukan kandungan mikotoksin dalam makanan dan pakan meliputi metode skrining, metode kuantitatif, analitis dan biologis. Metodologi mikotoksin berkembang sangat pesat. Jumlah metode yang dikembangkan dan berbagai modifikasi telah mencapai beberapa ratus dan terus bertambah.

Metode penyaringan yang sederhana dan cepat untuk melakukan analisis memungkinkan Anda dengan cepat dan andal "menyisih" sampel yang tidak terkontaminasi. Ini termasuk metode yang tersebar luas seperti uji kolom mini untuk aflatoksin, okratoksin A dan zearalenon; Metode TLC untuk penentuan simultan hingga 30 mikotoksin yang berbeda; deteksi fluoresen kontaminasi aflatoksin, dll.

Metode analisis kuantitatif untuk penentuan mikotoksin dapat dibagi menjadi kimia, radioimunokimia dan immunoassay enzim. Metode kimia saat ini paling umum dan mencakup tahap isolasi berurutan dan penentuan kuantitatif mikotoksin yang tepat. Tahap isolasi terdiri dari dua tahap: ekstraksi - pemisahan mikotoksin dari substrat, dan pemurnian - pemisahan mikotoksin dari senyawa dengan karakteristik fisikokimia yang serupa. Pemisahan akhir mikotoksin dilakukan dengan menggunakan satu atau dua dimensi kromatografi lapis tipis (KLT) pada pelat silika gel dalam berbagai sistem pelarut, kromatografi gas dan gas-cair, kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrometri massa. Penentuan kuantitatif mikotoksin biasanya dilakukan dengan perbandingan langsung intensitas fluoresensi selama KLT dalam sinar ultraviolet dengan standar konsentrasi yang diketahui, baik secara visual maupun densitometri. Untuk meningkatkan keandalan metode, berbagai uji konfirmasi digunakan, berdasarkan preparasi turunan mikotoksin dengan karakteristik kromatografi, kolorimetri, atau fluorimetri yang berbeda.

Beberapa tahun terakhir telah ditandai dengan meningkatnya perhatian pada pengembangan metode radioimmunochemical dan enzim immunoassay yang sangat sensitif dan sangat spesifik untuk deteksi, identifikasi dan kuantifikasi mikotoksin. Metode ini didasarkan pada persiapan antiserum untuk konjugasi mikotoksin dengan albumin serum sapi. Keuntungan mereka adalah sensitivitasnya yang luar biasa, yang memungkinkan untuk mendeteksi pikogram mikotoksin, dan untuk melakukan pengembangan ke arah otomatisasi proses penentuan. Metode biologis, yang biasanya tidak terlalu spesifik dan sensitif, terutama digunakan untuk mendeteksi mikotoksin yang tidak memiliki metode analisis kimia, atau sebagai uji konfirmasi. Benda uji adalah berbagai mikroorganisme, embrio ayam, banyak hewan laboratorium, kultur sel dan jaringan.

Tampilan