Acasă » Policarbonat » Metode pentru determinarea micotoxinelor și controlul contaminării alimentelor. Acțiunea micotoxinelor asupra corpului uman

Metode pentru determinarea micotoxinelor și controlul contaminării alimentelor. Acțiunea micotoxinelor asupra corpului uman

Metode moderne Detectarea și determinarea micotoxinelor din alimente și furaje includ metode de screening, metode analitice cantitative și metode biologice.

Metode de screening Acestea sunt rapide și convenabile pentru analiza loturilor, permițându-vă să separați rapid și fiabil probele contaminate și necontaminate. Metodele de screening includ cromatografia în strat subțire (metode TLC), o metodă de fluorescență pentru determinarea boabelor contaminate cu aflatoxine.

Metodele analitice cantitative pentru determinarea micotoxinelor sunt prezentate prin metode chimice, radioimunologice și de imunoanaliză enzimatică. În prezent, cele mai frecvente sunt metodele chimice, care includ două etape: etapa de izolare și etapa de determinare cantitativă a micotoxinelor. Etapa de izolare include extracția (separarea micotoxinei de substrat) și purificarea (separarea micotoxinei de compuși cu caracteristici fizico-chimice similare). Separarea finală și cuantificarea micotoxinelor se efectuează folosind diferite metode cromatografice. Cromatografia în strat subțire (TLC) este o metodă universală pentru determinarea tuturor tipurilor de micotoxine.

Atunci când se prelevează probe dintr-un lot de produse, sarcina principală este de a obține o probă medie sau o probă medie, în ceea ce privește concentrația de micotoxine, care este reprezentativă pentru întregul lot (probele prelevate trebuie să caracterizeze calitatea întregului lot). Această sarcină depinde de natura și distribuția micotoxinelor, de caracteristicile produsului (brut, procesat, cu curgere liberă, lichid, pastos etc.) și de metoda de preparare a probei. De exemplu, contaminarea arahidelor cu aflatoxine are o natură eterogenă pronunțată: în boabele de arahide individuale, conținutul lor poate varia de la mii de miligrame la zeci sau mai multe miligrame la 1 kg, adică diferă cu 5-6 ordine de mărime. Din acest motiv, contribuția erorii de eșantionare la eroarea analitică totală la determinarea aflatoxinelor din arahide este cea principală și, în unele cazuri, poate fi mai mare de 90%.

Din punct de vedere al uniformității contaminării cu micotoxine, toate produsele pot fi împărțite în două grupe: 1) produse cu un grad ridicat de eterogenitate (arahide decojite și necojite, semințe oleaginoase, boabe întregi sau grosolan măcinate, nuci); 2) produse cu caracter uniform de contaminare (lichide: lapte, uleiuri vegetale, sucuri, piureuri; făină, făină măcinată).

Pentru a obține un eșantion mediu reprezentativ de produse Primul grup mărimea eșantionului inițial trebuie să fie cât mai mare posibil (cel puțin 2 kg), în timp ce eșantionul mediu de laborator trebuie izolat de eșantionul mediu măcinat (omogenizat).

Pentru produse omogene din al doilea grup (gem, gem, sucuri de fructeîn cutii mici, lapte condensat, produse lactate uscate etc.), probele trebuie prelevate în numărul de unități de ambalare corespunzător dimensiunii eșantionului mediu (100-200 g), cu condiția ca produsul să provină dintr-un singur lot.

Metodele chimice pentru detectarea și identificarea aflatoxinelor individuale se bazează pe fluorescența lor specifică la lumina UV (aproximativ 365 nm), pe diferențele de mobilitate în timpul cromatografiei în strat subțire, pe specificul spectrelor lor de absorbție și fluorescență.

Spre deosebire de aflatoxine, trichotecenele nu prezintă absorbție sau fluorescență în partea vizibilă a spectrului, ceea ce le face dificil de detectat în cromatografia în strat subțire. Cu toate acestea, este posibilă detectarea tricotecenelor prin TLC folosind metode bazate pe tratamentul plăcilor TLC cu reactivi speciali care formează derivați colorați sau fluorescenți cu trichotecenele. De exemplu, toxina T -2 la prelucrarea plăcilor; acidul sulfuric concentrat formează pete cu fluorescență albastră;) în lumina UV.

Metodele de arbitraj pentru determinarea cantitativă a micotoxinelor sunt următoarele:

Cromatografie gaz-lichid (pentru toxina T-2);

Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) utilizând un detector fotometric UV (pentru deoxinivalenol și patulină);

HPLC utilizând un detector fluorescent (pentru aflatoxine; și zearalenonă).

În fig. 2 prezintă dispozitivul unui cromatograf lichid modern în cel mai simplu design.

Faza mobilă din rezervorul 1 prin filtrul de intrare 9 este alimentată de o pompă de înaltă presiune 2 către sistemul de introducere a probei 3 - un injector manual sau un autosamplator, iar proba este injectată acolo. Apoi, prin filtrul 8, eșantionul cu curentul fazei mobile intră prin precolumnă în coloana de separare 4. Apoi fluxul fazei mobile care părăsește coloana și conține componentele amestecului care trebuie separat (eluat) intră detectorul 5 și este îndepărtat în rezervorul de scurgere 7. Când eluatul curge prin măsurare circuitul detectorului este înregistrarea cromatogramei și transferul de date către înregistratorul 6 sau către computer.

Dispozitiv cromatograf lichid (sistem izocratic):

1 - capacitate; 2 - sistem de înaltă presiune; 3 - injector manual sau autosampler; 4 - coloană de divizare; 5 - detector; b - registrator sau computer; 7 - rezervor de scurgere; 8 - filtru; 9 - filtru de intrare

Sistemul prezentat în Fig. 2 este izocratic: compoziția fazei mobile nu se modifică în timpul cromatografiei. Dacă în cursul analizei cromatografice este necesară modificarea concentrației unuia sau mai multor componente ale fazei mobile, atunci sunt utilizate așa-numitele sisteme de gradient, constând de obicei din două sau mai multe pompe. În cazul eluției cu gradient, fiecare solvent este alimentat dintr-un vas separat într-o cameră specială de amestecare cu un agitator magnetic, unde, conform unui anumit program, sunt amestecați cu un raport dat de volume.

Pentru analiza micotoxinelor, se folosesc adesea sisteme de gradient, unde soluțiile de acetonitril în apă cu o concentrație care variază liniar în timp sunt utilizate ca fază mobilă.

Coloana cromatografică este un tub metalic de la 150 la 250 mm cu un diametru interior de 4,6 mm, umplut cu un sorbent special pe bază de silicagel cu radicali hidrocarburi altoiți. Coloana de protecție servește pentru a proteja coloana cromatografică de contaminare.

Detectorul fotometric UV este cel mai comun tip de detector HPLC. Principiul de funcționare al detectorului este similar cu principiul de funcționare al unui spectrofotometru convențional: înregistrează densitatea optică a unei soluții. Diferența este că detectorul UV este unul care trece prin flux, în loc de o cuvă cu o soluție, folosește o celulă fotometrică. Fluxul eluant curge prin celula de lucru și un flux de fază mobilă pură este direcționat prin celula de referință. Sursa de lumină este o lampă cu mercur care emite radiații UV intense. Lumina cu lungimea de undă dorită este emisă utilizând filtre optice adecvate, trece prin celule, este parțial absorbită de moleculele fazei mobile și de componentele separate și este captată de un fotodetector. Absorbția luminii (densitatea optică) a eluatului este înregistrată continuu de un aparat de înregistrare sau computer, înregistrând o cromatogramă. Componentele separate ale amestecului (de exemplu, micotoxine) sunt prezentate în cromatogramă ca vârfuri. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată pentru identificarea substanței, iar aria vârfului pentru determinarea cantitativă.

Un dispozitiv mai sofisticat este un detector de fluorescență (fluorometric). Acest detector exploatează capacitatea compușilor organici, în special a aflatoxinelor și a zearalenonei, de a fluoriza atunci când sunt expuși la radiații UV sau radiații vizibile. Detectorul de fluorescență are o celulă de flux cu două canale optice reciproc perpendiculare. Una dintre ele servește pentru a furniza radiația excitantă, cealaltă permite uneia să măsoare intensitatea fluorescenței. În cazul analizei aflatoxinelor B 1 și M 1, lungimea de undă de excitație este de 360 nm, iar lungimea de undă a radiației emise este de 420 nm.

Trebuie remarcat faptul că un detector UV poate fi utilizat și pentru analiza aflatoxinelor, dar sensibilitatea acestuia este un ordin de mărime mai mic decât cel al unui detector fluorometric; prin urmare, atunci când se analizează concentrații scăzute de aflatoxine (la nivelul MPC și mai jos) , este preferabilă detectarea fluorescenței.

D.M. Zubovsky, instituția de stat „Centrul veterinar de stat din Belarus”, medic veterinar șef

Metoda a fost dezvoltată în continuare sub denumirea de cromatografie în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC, HPTLC). Reducerea grosimii stratului de fază staționară (până la 100 microni) și a dimensiunii particulelor (până la 5 microni) a dus la o mai bună separare a substanțelor într-o perioadă mai scurtă de timp.
Metodele TLC sunt disponibile pentru aproape toate micotoxinele. Detectarea și identificarea specifică sunt concepute pentru fiecare micotoxină individuală utilizând proprietăți moleculare sau reacții de transformare.

Principalele dezavantaje ale cromatografiei în strat subțire sunt:
§ productivitate scăzută;
§ Majoritatea probelor au nevoie de pași de extracție și purificare pentru a elimina interferențele potențiale și compușii matriciali înainte de analiză;
§ concentrația analitului trebuie să fie în intervalul 0,01-0,1%;
§ utilizarea substanțelor toxice și materie volatilă ca solvent.
Metodele de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) în domeniul cercetării micotoxinelor sunt utilizate în principal pentru separarea finală a compușilor matriciali și pentru detectarea analitului de interes. Metodele HPLC sunt utilizate pe scară largă astăzi datorită performanței și fiabilității lor superioare comparativ cu cromatografia în strat subțire. Metodele HPLC au fost dezvoltate pentru majoritatea micotoxinelor majore din cereale și alte produse agricole. Majoritatea metodelor sunt fiabile și stabile.
Metoda HPLC se bazează pe separarea extractului analizat în faza staționară a unei coloane cromatografice (Figura 3) (coloanele C8 și C18 sunt mai des utilizate pentru analiza micotoxinelor) și identificarea lor ulterioară și determinarea cantitativă folosind detectoare speciale. Cele mai frecvente detectoare pentru analiza micotoxinelor de astăzi sunt ultraviolete și fluorescente.
Limitele de sensibilitate ale metodelor HPLC care utilizează aceste detectoare pot fi de până la 1 μg / kg de probă.
Dezvoltarea metodelor HPLC pentru analiza simultană a micotoxinelor multiple a fost raportată în literatura de specialitate. Micotoxinele trichotecene, în special trichotecenele, sunt analizate cu succes în acest mod.

În practică, pentru studiul furajelor și alimentelor pe teren, condițiile de producție și laboratoarele de testare, sunt necesare metode care să permită cercetări cantitative și rapide număr mare probe pentru prezența micotoxinelor, dacă este posibil cu cel mai mic cost al efortului și resurselor financiare.
Toate aceste caracteristici sunt îndeplinite prin metode bazate pe reacții imunologice. Metodele imunologice disponibile în comerț pentru analiza micotoxinelor se bazează pe utilizarea anticorpilor monoclonali și policlonali specifici împotriva anumitor toxine și sunt, în general, împărțite în:
§ metoda bazată pe coloane de imunoaffinitate (IAC, IAC);
§ test imunosorbent legat de enzime (ELISA, ELISA) (tabelul 1).

De obicei, coloanele de imunoaffinitate sunt de fapt utilizate pentru purificarea probei din compuși matriciali și permit izolarea și concentrația unei anumite micotoxine.
Eluția ulterioară a toxinei din IAC permite determinarea cantitativă folosind metode analitice clasice. În cazul testului imunoenzimatic enzimatic, procedurile de curățare nu sunt, de obicei, la fel de intensive ca în cazul altor metode analitice. Un omogenat sau un extract de eșantion care conține o micotoxină este fie cuantificat direct folosind o placă de microtitrare standard sau testul ELISA tub, fie un test cu membrană imunosorbentă legată de enzime este utilizat pentru a determina calitativ sau semi-cantitativ prezența micotoxinelor.
Alte metode pentru studiul micotoxinelor utilizând o abordare imunologică raportată în literatură includ biosenzorii optici și acustici, electroforeza capilară.

Coloanele de imunoafinitate sunt utilizate în mod obișnuit pentru a purifica o probă de testare din matrici complexe și concentrația de toxine înainte de a detecta și evalua conținutul de micotoxină utilizând o serie de metode analitice clasice, cum ar fi HPLC, cromatografie în fază gazoasă, spectrometrie de masă, fluorometrie, HPTLC și TLC. Metoda constă în injectarea extractului de probă într-o coloană care conține o matrice de imunoaffinitate care conține o fază solidă (de exemplu, margele de agaroză) de care sunt atașați covalent anticorpii anti-micotoxină (Figura 4). Molecula de toxină conținută în probă se leagă de anticorpul imobilizat corespunzător. Etapele ulterioare includ îndepărtarea componentelor matricei nelegate și a extractantului, eluarea toxinei prin modificarea compoziției de eluare și, în cele din urmă, detectarea toxinei utilizând metode analitice. Alternativ, micotoxina legată de coloană poate fi eluată și măsurată direct prin fluorometrie pe baza fluorescenței intrinseci a micotoxinelor.
Testul cu membrană permite o scurtă perioadă de timp (aproximativ 10-15 minute) pentru a răspunde la întrebarea: micotoxinele sunt prezente în proba de test peste limita de sensibilitate a acestui test? Aceasta este, de fapt, aceasta este o determinare calitativă a prezenței / absenței micotoxinelor în probă. Metoda necesită extracție, filtrare, purificare (prin coloană) și diluarea probei. Apoi, soluția se aplică pe o membrană sensibilizată cu anticorpi monoclonali, la care se adaugă și conjugatul enzimei micotoxinei. Dacă concentrația de micotoxine din probă depășește limita de detecție a testului, toți anticorpii de pe suprafață se leagă de ei și tot conjugatul adăugat este îndepărtat în timpul etapei de spălare. Când se adaugă un substrat incolor, conjugatul de pe suprafața membranei catalizează o reacție de culoare, ca urmare a căreia se formează o pată colorată la locul de legare a conjugatului. Colorarea zonei analitice a membranei indică absența micotoxinelor în probă.
O analiză imunosorbentă legată de enzime este frecvent utilizată pentru a monitoriza prezența micotoxinelor peste un anumit nivel (sau lipsa acestora) într-o probă de testare. În prezent sunt disponibile o serie de metode calitative, semicantitative și cantitative. Pe baza rezultatelor ELISA, probele suspecte ar trebui verificate din nou folosind metode clasice. Disponibil diferite opțiuni ELISA pentru analiza micotoxinei (de exemplu, teste de membrană, plăci de microtitrare și metode cu tuburi). În mod tipic, ELISA se bazează pe un test concurent care utilizează fie micotoxine conjugate cu enzime, fie anticorpi împotriva unei toxine specifice de interes (Figura 5). O secvență tipică de reacții care utilizează reactivi gata gata în format de placă de microtitrare este după cum urmează:
1. conjugat enzimatic se adaugă la extractul probei de testat;
2. amestecul se adaugă la anticorpii corespunzători aplicați pe suprafața godeurilor plăcii (de exemplu, o placă de microtitrare, acoperită cu anticorpi);
3. cantitatea de conjugat legat de toxina legată de anticorpii imobilizați depinde de cantitatea de toxină din probă; cu cât cantitatea de toxină din probă este mai mare, cu atât va fi mai mică cantitatea de conjugat enzimatic atașat anticorpilor aplicați pe suprafața godeurilor plăcii și invers;
4. Activitatea enzimatică a conjugatului legat de anticorpii de suprafață este determinată de adăugarea unui substrat adecvat, care duce la formarea de produse colorate, a căror concentrație este invers proporțională cu concentrația toxinei din proba de testare.

Pe baza Centrului veterinar de stat din Belarus, în perioada 2004-2006. analiza conținutului de micotoxine din furaje a fost efectuată utilizând testul imunosorbent legat de enzime. Pentru studiu, am folosit sisteme de testare gata fabricate de R-Biopharm, Germania. Această companie produce o serie de kituri pentru determinarea cantitativă a micotoxinelor: aflatoxine B, G, M, zearalenonă, ochratoxină A, toxină T-2, deoxinivalenol, fumonisină B1, citrinină. Trebuie remarcat faptul că pentru aproape toate micotoxinele enumerate există sisteme de testare pentru determinarea concentrațiilor deosebit de scăzute ale acestor compuși toxici cu o limită de sensibilitate la nivelul metodelor cromatografice (RIDASCREEN® Mycotoxins) (timp de incubare 1-2 ore) ) și exprimă metode care permit să se determine practic aceeași concentrație timp de 15-30 de minute (RIDASCREEN® FAST Micotoxins). Toate metodele au fost aprobate în Republica Belarus și pot fi utilizate în laboratoare care fac parte din structura ministerului. Agricultură si mancare.
Organizarea analizei micotoxinelor din furaje și alimente prin metoda imunologică enzimatică este posibilă cu mijloace minime și în cele mai timp scurt... Ușurința de funcționare și costul redus al echipamentului necesar diferențiază în mod favorabil imunoanaliza enzimatică de metodele clasice de analiză (tabelele 2, 3) și o fac deosebit de atractivă pentru laboratoarele cu resurse financiare limitate.
Trebuie remarcat faptul că, cu indicatori practic egali ai limitelor de detecție, metodele de testare imunosorbentă legată de enzime sunt mai productive și permit studiul selectiv al eșantioanelor suspecte de ELISA prin metode instrumentale. De exemplu, folosind metoda ELISA, un asistent de laborator poate analiza 10-100 de eșantioane într-o singură schimbare de lucru, în timp ce utilizează HPLC, doar 1-10 eșantioane. În acest caz, imunoanaliza enzimatică durează de la 15 minute la 3 ore (prepararea probei până la 1 oră) și prin HPLC - 2-4 ore cu 1-3 zile de preparare a probei.

Concluzii. Studiile pentru identificarea contaminării furajelor cu micotoxine în această perioadă au făcut posibilă diagnosticarea focarelor bruște de boli în mai multe ferme din republică, ceea ce a făcut posibilă aplicarea unor măsuri adecvate și, prin urmare, reducerea pierderilor economice ale producătorilor.
Costurile unui studiu în timp util al furajelor din propria noastră producție, și cu atât mai mult achiziționate în alte țări, vor fi întotdeauna mai mici decât costurile efectuării diagnosticului de urgență a unui focar de boală, luând măsurile necesare pentru utilizarea sau eliminarea hrana contaminată, precum și pierderile cauzate de scăderea productivității și de moartea animalelor.

Literatură:
1. Bioaerosoli: evaluare și control, 24.1.3. - ACGIH, Cincinnati, OH 1999.
2. Standarde veterinare și sanitare pentru siguranța furajelor și a aditivilor pentru hrana animalelor :: Nr. 48: aprobat. Ministerul Agriculturii și Alimentației din Republica Belarus din 28.04.08: contribuție. efectiv 28.04.08.
3. Rețeaua europeană de informații privind micotoxicologia. - http://www.mycotoxins.org
4. Regulamentul Comisiei Europene nr. 466/2001 din 8 martie 2001 „Stabilirea nivelurilor maxime admise pentru anumiți contaminanți din alimente”. - JO L 77, 16.03.2001. - pag. 1.

Micotoxine și metode pentru determinarea lor

Micotoxinele (din grecescul mykes - ciupercă și toxikon - otravă) sunt metaboliți secundari ai matrițelor microscopice cu proprietăți toxice pronunțate. Pericolul ridicat al micotoxinelor se exprimă prin faptul că au un efect toxic în cantități extrem de mici și sunt capabili să se difuzeze foarte intens în adâncimea produsului.

Aflatoxinele fac parte din cel mai periculos grup de micotoxine cu hepatotoxine puternice și proprietăți cancerigene. Aflatoxinele sunt produse de diferite tulpini de doar două specii de Aspergillus (Aspergillus flavus și Aspergillus parasiticus), care sunt răspândite în întreaga lume. Trebuie remarcat faptul că ciupercile toxigene pot infecta substraturile plantelor nu numai în timpul depozitării, ci și în timpul creșterii, recoltării, transportului și prelucrării acestora.

Familia aflatoxinelor include patru reprezentanți principali (aflatoxine B 1, B 2, G 1, G 2), precum și mai mult de 10 compuși care sunt derivați sau metaboliți ai grupului principal (M 1, M 2, B 2a, G 2a , GM 1, P 1, Q 1 etc.).

V condiții naturale Aflatoxinele se găsesc mai des și în cele mai mari cantități în arahide, porumb și semințe de bumbac. În plus, se pot acumula în cantități semnificative în diverse nuci, semințe oleaginoase, grâu, orz, cacao și cafea, precum și în hrana animalelor de fermă.

Trebuie remarcată posibilitatea apariției aflatoxinelor în produsele de origine animală: în lapte, țesuturi și organe ale animalelor care au primit furaje contaminate cu aflatoxine în concentrații mari.

S-a dovedit că vacile excretă cu lapte de la 0,35 la 2-3% aflatoxină B 1 obținută cu furaje sub formă de metabolit foarte toxic - aflatoxină M 1 În același timp, pasteurizarea laptelui și procesul de uscare nu sunt semnificative afectează conținutul de aflatoxină M 1 din acesta. Aflatoxina M 1 a fost găsită atât în laptele integral, cât și în laptele uscat și chiar în produsele lactate care au suferit prelucrări tehnologice (pasteurizare, sterilizare, fabricarea brânzei de vaci, iaurt, brânzeturi etc.). Deci, în procesul de obținere a brânzei din lapte contaminat, 50% din aflatoxina M 1 este determinată în masa de caș. La primirea untului, 10% din aflatoxina M 1 intră în smântână, 75% rămân în laptele degresat.

Aflatoxinele sunt slab solubile în apă, insolubile în solvenți nepolari, dar ușor solubili în solvenți polari medii, cum ar fi cloroform, metanol și dimetil sulfoxid. Sunt destul de instabile sub formă chimică pură și sunt sensibile la efectele aerului și luminii.

Aflatoxinele nu sunt practic distruse în timpul procesării culinare normale a alimentelor contaminate.

Micotoxinele trichotecene sunt metaboliți secundari ai ciupercilor microscopice din genul Fusarium, care infectează hrana și hrana, în urma cărora se produce toxicoza nutrițională la animale și la oameni. Acestea se găsesc cel mai frecvent în boabele de porumb, grâu și orz. Micotoxinele din acest grup sunt omniprezente, în special în țările cu un climat continental temperat. Nu este neobișnuit ca două sau mai multe micotoxine să se găsească în același produs. La efectuarea certificării obligatorii, se asigură controlul asupra conținutului a doi reprezentanți ai acestui grup, și anume, deoxinivalenolul și toxina T-2 sunt standardizate.

Deoxinivalenol(DON), una dintre cele mai frecvente fusariotoxine, inhibă sinteza proteinelor, reduce concentrația de ytgunogaobulină în serul sanguin și poate suprima sistemul de reproducere. Contaminarea furajelor pentru animalele de fermă este deosebit de periculoasă. Astfel, DON induce vărsături la animale, reduce aportul de furaje la purcei. Toxina T-2 mai puțin răspândită, dar mai toxică decât DON. Toxina T-2 provoacă iritații, hemoragii și necroze în tractul digestiv. Intoxicația acută cu trichotecene este însoțită de deteriorarea organelor hematopoietice și imun-competente. Caracterizat prin dezvoltarea sindromului hemoragic, refuzul de a se hrăni, vărsături.

Zearalenona și derivații săi sunt, de asemenea, produși de ciuperci microscopice din genul Fusarium. Principalul substrat natural în care se găsește cel mai frecvent Zearalenona este porumbul. Ciupercile din genul Fusariurn graminearum atacă adesea porumbul în câmpul în picioare și provoacă putregaiul porumbului și tulpinii. Porumbul poate fi, de asemenea, contaminat cu Zearalenonă în timpul depozitării. Rata de detectare a zearalenonei este ridicată în furajele mixte, precum și în grâu, orz și ovăz. Dintre alimente, această toxină a fost găsită în faina de porumb, cereale și bere din porumb.

Zearalenona are un efect estrogen și teratogen pronunțat și este o problemă gravă pentru creșterea animalelor în multe țări, iar capacitatea acestei micotoxine de a se acumula în țesuturile animalelor de fermă îl face potențial periculos pentru sănătatea umană. Contaminarea cu zearalenonă a furajelor determină scăderea fertilității, avortului, infertilității și bolilor inflamatorii la porci, vaci, păsări de curte și iepuri. Cu toate acestea, până de curând, unii derivați ai zearalenonei au fost folosiți ca stimulatori de creștere la animale și au fost produși pe scară largă de către industrie.

Patulina este o micotoxină deosebit de periculoasă cu proprietăți cancerigene și mutagene. Principalii producători de patulină sunt ciupercile microscopice Penicillium patulum și Penicillium expansum. Producătorii de patulină afectează în principal fructele și unele legume, provocând putrezirea acestora. Patulin se găsește în mere, pere, caise, piersici, cireșe, struguri, banane, căpșuni, afine, lingonberries, cătină, gutui și roșii. Merele sunt cel mai adesea afectate de patulină, unde conținutul de toxine poate ajunge la 17,5 mg / kg. Trebuie remarcat faptul că patulina se găsește nu numai în partea putredă a fructelor și legumelor, ci și în partea normală. De exemplu, la tomate, patulina este distribuită uniform pe întregul țesut.

Patulinul se găsește și în concentrații mari în fructele și legumele procesate: sucuri, compoturi, mop și gemuri. Se găsește mai ales în sucul de mere (0,02-0,4 mg / l). Conținutul de patulină în alte tipuri de sucuri: pere, gutui, struguri, prune, mango - variază de la 0,005 la 4,5 mg / l.

Controlul asupra conținutului de micotoxine este obligatoriu la certificarea materiilor prime alimentare și a produselor alimentare. În Rusia, au fost adoptate standarde sanitare și igienice pentru conținutul de micotoxine din alimente, prezentate în tabel. 12.

Sistemul de măsuri pentru prevenirea micotoxicozei include analize sanitare și micologice ale produselor alimentare (Fig. 13).

Tabelul 12. Nivelurile admisibile de micotoxine în anumite grupe de alimente

În plus, se acordă multă atenție găsirii modalităților de decontaminare și detoxifiere a materiilor prime și a produselor alimentare contaminate cu micotoxine. În acest scop, se utilizează metode mecanice, fizice și chimice:

1) mecanic- separarea manuală a materialului contaminat sau cu ajutorul sortatoarelor calorimetrice electronice;

2) fizic tratament termic, expunere la radiații ultraviolete;

3) chimic- tratamentul cu soluții de agenți oxidanți, acizi puternici și baze.

Cu toate acestea, utilizarea metodelor mecanice și fizice de purificare nu dă un efect ridicat, metodele chimice duc la distrugerea nu numai a micotoxinelor, ci și a nutrienților utili, precum și la o încălcare a absorbției lor.

Orez. 12. Analiza sanitară și microbiologică a produselor alimentare

14.8.1 Metode de determinare a micotoxinelor

Metodele moderne de detectare și determinare a conținutului de micotoxine din alimente și furaje includ metode de screening, metode analitice cantitative și metode biologice.

Metodele de scriptare sunt rapide și convenabile pentru analiza în serie, permițându-vă să separați rapid și fiabil probele contaminate și necontaminate. Metodele de screening includ cromatografia în strat subțire (metode TLC), o metodă de fluorescență pentru determinarea boabelor contaminate cu aflatoxine.

Metodele analitice cantitative pentru determinarea micotoxinelor sunt prezentate prin metode chimice, radioimunologice și imunoenzime. În prezent, cele mai frecvente sunt metodele chimice, care includ două etape: o etapă de izolare și o etapă pentru determinarea cantitativă a micotoxinelor. Etapa de izolare include extracția (separarea micotoxinei de substrat) și purificarea (separarea micotoxinei dintr-un compus cu caracteristici fizico-chimice similare). Separarea finală și cuantificarea micotoxinelor se efectuează folosind diferite metode cromatografice. O metodă universală pentru determinarea tuturor tipurilor de micotoxine este cromatografia în strat subțire (TLC).

în boabele de arahide individuale, conținutul lor poate varia de la mii de miligrame la zeci sau mai multe miligrame la 1 kg, adică variază cu 5-6 ordine de mărime. Din acest motiv, contribuția erorii de eșantionare la eroarea analitică totală la determinarea aflatoxinelor din arahide este cea principală și, în unele cazuri, poate fi mai mare de 90%.

Din punct de vedere al uniformității contaminării cu micotoxine, greutatea produselor poate fi împărțită în două grupe: 1) produse cu un grad ridicat de eterogenitate (arahide decojite și necojite, semințe oleaginoase, cereale integrale sau grosiere, nuci); 2) produse cu caracter uniform de contaminare (lichide: lapte, uleiuri vegetale, sucuri, țărm; făină, făină măcinată).

Pentru a obține un eșantion mediu reprezentativ de produse din grupa 1, dimensiunea eșantionului inițial trebuie să fie cât mai mare posibil (cel puțin 2 kg), în timp ce eșantionul mediu de laborator trebuie izolat de eșantionul mediu măcinat (omogenizat).

Pentru produsele omogene din grupa a 2-a (gem, gem, sucuri de fructe în recipiente mici de tablă, lapte condensat, produse lactate uscate etc.), probele trebuie prelevate în numărul de unități de ambalare corespunzător dimensiunii eșantionului mediu (100 -200 g), cu condiția ca produsul să provină din același lot.

Spre deosebire de aflatoxine, trichotecenele nu prezintă absorbție sau fluorescență în partea vizibilă a spectrului, ceea ce le face dificil de detectat în cromatografia în strat subțire. Cu toate acestea, este posibilă detectarea tricotecenelor prin TLC folosind metode bazate pe tratamentul plăcilor TLC cu reactivi speciali care formează derivați colorați sau fluorescenți cu trichotecenele. De exemplu, toxina T-2, atunci când este tratată cu acid sulfuric concentrat, formează pete cu fluorescență albastră în lumina UV.

Metodele de arbitraj pentru determinarea cantitativă a micotoxinelor sunt următoarele:

Cromatografie gaz-lichid (pentru toxina T-2);

Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) utilizând un detector fotomustral UV (pentru deoxinivalenol și patulină);

HPLC folosind un detector fluorescent (pentru aflatoxips și zearalenonă).

Pentru analiza micotoxinelor, se folosesc adesea sisteme HPLC cu gradient, în care soluțiile de acetonitril în apă cu o concentrație care variază liniar în timp sunt utilizate ca fază mobilă.

Coloana cromatografică este un tub metalic cu lungimea de 150 până la 250 mm cu un diametru interior de 4,6 mm, umplut cu un sorbent special pe bază de silicagel cu radicali hidrocarburi altoiți. Coloana de protecție servește pentru a proteja coloana cromatografică de contaminare.

Detectorul fotomeoric UV este cel mai comun tip de detector HPLC. Principiul de funcționare al detectorului este similar cu principiul de funcționare al unui fotometru spectral convențional: înregistrează densitatea optică a unei soluții. Diferența este că detectorul UV este unul care trece prin flux, în loc de o cuvă cu o soluție, folosește o celulă fotometrică. Fluxul eluant curge prin celula de lucru, iar fluxul pur de fază mobilă este direcționat prin celula de referință. Sursa de lumină este o lampă cu mercur care emite radiații UV intense. Lumina cu lungimea de undă dorită este emisă utilizând filtre optice adecvate, trece prin celule, este parțial absorbită de moleculele fazei mobile și de componentele separate și este captată de un fotodetector. Absorbția luminii (densitatea optică) a eluatului este înregistrată continuu de un aparat de înregistrare sau computer, înregistrând o cromatogramă. Componentele separate ale amestecului (de exemplu, micotoxine) sunt prezentate în cromatogramă ca vârfuri. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată pentru identificarea substanței, iar aria vârfului pentru determinarea cantitativă.

Trebuie remarcat faptul că un detector UV poate fi utilizat și pentru analiza aflatoxinelor; cu toate acestea, sensibilitatea acestuia este un ordin de mărime mai mic decât cel al unui detector fluorometric; prin urmare, atunci când se analizează concentrații scăzute de aflatoxine (la nivelul MPC și sub ), este preferabilă detectarea fluorescenței.

Se propune o metodă expresă, sigură și economică pentru determinarea micotoxinelor în produsele de origine animală și vegetală. Determinarea se efectuează dintr-o probă de 2 g, extractul purificat de QuEChERS este împărțit în trei părți de 2 ml și utilizat ca dispersant 300 μl de cloroform într-o microextracție dispersantă lichid-lichid. Extractele obținute sunt luate în microflaconi, solventul este evaporat și reziduul din primul și al treilea microflacon este dizolvat în 50 μl de acetonitril, în al doilea - în 50 μl de hexan. În primul microflacon, aflatoxinele (B1, B2, G1, G2), zearalenona și ochratoxina A sunt determinate prin HPLC cu un detector fluorometric; în al doilea, micotoxinele trichotocene (deoxinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2 acetildeoxinivalenol), patulină, ochratoxină A și zearalenonă prin cromatografie gaz-lichid cu detector de captare de electroni, în al treilea - patulină și zearalenonă prin HPLC cu detector cu diodă. Durata determinării micotoxinelor este de 1,5-2 ore cu lucru simultan pe 3 cromatografe. Pregătirea probei necesită 10,1 ml acetonitril, 0,9 ml cloroform și 0,05 ml hexan. Utilizarea diferitelor opțiuni de cromatografie pentru determinarea patulinei, zearalenonei, ochratoxinei A duce la rezultate de analiză mai fiabile. 1 tbl, 1 ex

Invenția se referă la industria alimentară și de prelucrare și poate fi utilizată pentru a determina conținutul de micotoxine din produsele alimentare, cerealele, hrana animalelor și carnea pentru a evalua siguranța acestora.

În prezent, nu au fost propuse metode pentru determinarea tuturor micotoxinelor standardizate dintr-o probă. Sunt cunoscute metode pentru determinarea micotoxinelor individuale sau a claselor individuale.

Deci, pentru determinarea zearalenonei, T-2, ochratoxinei A, cromatografia în strat subțire este utilizată separat pentru fiecare toxină (GOST 28001-88. Metode de determinare a micotoxinelor T-2, zearalenonei și ochratoxinei A. Cereale furajere, produse din prelucrare, furaje mixte). Metoda este extrem de complexă, consumă mult timp și permite determinarea semi-cantitativă a micotoxinelor indicate pentru fiecare dintr-o probă separată.

O metodă cunoscută pentru determinarea aflatoxinelor (B1, B2, G1, G2) prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție fluorometrică (GOST R 53162-2008. Produse alimentare. Determinarea aflatoxinei B1 și a conținutului total de aflatoxine B1, B2, G1 , G2). Aflatoxinele sunt extrase cu metanol, extractul este purificat și concentrat pe o coloană de imunoaffinitate, eluat cu metanol, evaporat la un volum mic și cromatografiat. Tehnica este consumatoare de timp, costisitoare și necesită utilizarea unei cantități mari de solvenți.

O metodă cunoscută pentru determinarea deoxinivalenolului (GOST R 51116-97. Furaje compuse, cereale, produse de prelucrare a acestuia. Metodă de determinare a conținutului deoxinivalenol), bazată pe extracția micotoxinei din proba cu acetonitril, purificarea extractului pe două coloane succesive cu cărbune, eluare deoxinivalenol cu acetonitril, până la volumul de evaporare și analiză prin cromatografie lichidă cu detector UV. Cu toate acestea, metoda propusă este consumatoare de timp, laborioasă și nu permite determinarea simultană a tuturor micotoxinelor.

O metodă cunoscută pentru determinarea patulinei (brevetul RF nr. 2056044, G01N 33/02. Metodă pentru determinarea cantitativă a patulinei în alimente), bazată pe extracția patulinei dintr-o probă cu acetat de etil, purificarea extractului pe un adsorbant, concentrația extractului și analiza prin cromatografie lichidă. Tehnica este lungă și necesită utilizarea unei cantități mari de solvenți.

Există o metodă pentru determinarea simultană a micotoxinelor tricotecene și a zearalenonei în cereale prin cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă (Toshitsuga Tanaka at al. Determinarea simultană a micotoxinelor trichotecene și zearalenonă în cereale prin cromatografie în gaz-spectrometrie de masă / J. Chromatogr. A. 2000 882. P. .23-28). Esența sa constă în extracția micotoxinelor din 10 g dintr-o porțiune cântărită de 100 ml acetonitril timp de 30 de minute, îndepărtarea grăsimii prin extracție cu 20 ml hexan, evaporarea extractului acetonitril la sec, dizolvarea reziduului uscat într-o amestec de metanol cu cloroform, purificarea extractului pe coloană cu Florisil, evaporarea extractului la sec, dizolvarea reziduului în 2 ml de metanol, derivatizarea cu tetrametilsilan și apoi cromatografie. Metoda consumă mult timp, necesită multă muncă și este costisitoare.

O metodă cunoscută pentru determinarea simultană a aflatoxinelor, ochratoxinei A și a zearalenonei în boabe prin cromatografie de înaltă performanță cu un detector fluorometric (Gobel R., Lusky K. Determinarea simultană a aflatoxinelor, ochratoxinei A și zearalenonei în boabe prin noua coloană imunoaffinity / lichid chimic cromatografie / contaminanți alimentari 2004.. V.87. Nr. 2. P.411-418). Esența sa este extragerea micotoxinelor dintr-o probă de 25 g de 100 ml soluție de acetonitril, purificarea extractului pe o coloană de imunoaffinitate, extragerea a 2 ml de metanol din coloana de micotoxină, evaporarea extractului la sec, dizolvarea reziduului în hexan, derivatizarea reziduu cu acid trifluoroacetic până la sec, se evaporă soluția la sec timp de 15 min. metanol și determinarea micotoxinelor la diferite lungimi de undă (aflatoxine - 360-440 nm, zearalenonă - 276-466 nm și ochratoxină A - 330-460 nm). Metoda este consumatoare de timp și laborioasă și necesită o cantitate mare de solvenți.

Cea mai apropiată de metoda propusă este metoda pentru determinarea simultană a aflatoxinelor în produsele din cereale (Campone L., Piccinelli AL, Cetano R., Rastrelli L. Aplicarea microextracției dispersive lichid-lichid pentru determinarea aflatoxinelor B1, B2, G1, G2 în produse cerealiere / J Chromatogr. A. 2011 1248 P.7548-7554). Esența sa este extragerea micotoxinelor dintr-o probă de 25 g de 100 ml soluție de metanol, îndepărtarea grăsimii prin extracție cu 6 ml hexan, purificarea 1 ml din extract folosind microextracție dispersivă lichid-lichid cu cloroform (220 μl), îndepărtarea cloroformului, se dizolvă reziduul în 0,1 ml de metanol și determinarea aflatoxinelor prin PELC cu un detector fluorometric. Factorul de concentrație al micotoxinelor este de 2,0-2,5. Cu toate acestea, metoda consumă mult timp, necesită o cantitate mare de solvenți, un coeficient de concentrație scăzut și nu permite determinarea altor micotoxine din același extract. Durata analizei numai pentru aflatoxine este de 1,5-2 ore.

Scopul invenției este de a reduce durata analizei, de a crește reproductibilitatea și fiabilitatea rezultatelor analizei, de a reduce consumul de solvenți organici și de a asigura siguranța operatorului.

Acest obiectiv este atins prin faptul că, conform metodei de determinare a micotoxinelor, inclusiv prelevarea de probe, extracția micotoxinelor cu acetonitril în prezența agenților de sărire, purificarea extractului cu sorbanți în vrac (metoda de preparare a probei conform QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck FJ // J. AOAC Int. 2003. V.86. No. 2. P.412), centrifugare și determinare prin metode cromatografice. În metoda propusă, extracția se efectuează din 2 g de probă, extractul purificat este împărțit în trei părți de câte 2 ml fiecare și utilizat ca dispersant în dispersie micro-extracție lichid-lichid cu adăugarea la prima parte (pentru determinarea aflatoxinelor, ochratoxinei A și zearalenonei) 300 μl cloroform conținând 0,05% iod, la a doua (pentru determinarea micotoxinelor trichotocene, patulină, zearalenonă, ochratoxină A) - 300 μl cloroform conținând 50 μl anhidridă trifluoroacetică, până la al treilea (pentru determinarea patulinei și zearalenonei) - 300 μl de cloroform, apoi amestecurile rezultate sunt injectate fiecare separat folosind o seringă în 5 ml de apă într-un tub de centrifugă cu o capacitate de 15 ml cu fund conic, incubat timp de 30 s într-o baie cu ultrasunete, centrifugată la 3000 rpm timp de 5 min, straturile inferioare ale extractului sunt luate în microviale, solventul este purjat cu azot și reziduul din primul și al treilea microvial se dizolvă în 50 μl de acetonitril, în al doilea - în 50 μl hexan, în primul m Icroflacona determină aflatoxinele (B1, B2, G1, G2), ochratoxina A și zearalenona prin HPLC cu un detector fluorometric, în al doilea, micotoxinele trichotocene (deoxinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooxiscirpenelenol, 13- și patulin zearalenonă, ochratoxină A) prin cromatografie gaz-lichid cu detector de captare de electroni, în al treilea - patulină și zearalenonă prin HPLC cu un detector cu diode.

Un exemplu de determinare a micotoxinelor. Așezați 2.000 g de produs zdrobit (cereale, furaje, carne) într-o eprubetă cu o capacitate de 50 ml, adăugați 10 ml acetonitril și 10 ml apă, agitați energic timp de 5 minute, turnați un amestec de săruri (4 g sulfat de magneziu, 1 g clorură de sodiu, 1 g citrat de sodiu monohidrat și 0,5 g citrat de sodiu 1,5-apă), acoperiți și agitați energic timp de 1-2 minute, apoi centrifugați timp de 5 minute la 3000 rpm. Se iau 8 ml din extractul obținut într-o eprubetă de 15 ml care conține 0,9 g sulfat de magneziu, 0,2 g de Bondesil PSA și sorbiți C18, se agită energic timp de 1-2 minute, apoi se centrifughează 5 minute la 3000 rpm.

În trei eprubete se iau 2 ml din extractul obținut. În primul, se adaugă 300 μl de cloroform care conține 0,05% iod, în al doilea - 300 μl de cloroform conținând 50 μl de anhidridă trifluoroacetică, în al treilea - 300 μl de cloroform, apoi amestecurile rezultate sunt injectate separat fiecare folosind o seringă în 5 ml de apă în tuburi de centrifugă conice, incubate timp de 30 s într-o baie cu ultrasunete și centrifugate la 3000 rpm timp de 5 minute, straturile inferioare ale extractelor sunt luate în microflaconi, solventul este purjat cu azot și reziduul în primul și al treilea microflaconi se dizolvă în 50 μl de acetonitril, în al doilea - în 50 μl hexan.

În primul microflacon, aflatoxinele (B1, B2, G1, G2), ochratoxina A și zearalenona sunt determinate prin HPLC cu un detector fluorometric. Condiții cromatografice: coloana "Kromasil C18", 150 mm, fază mobilă acetonitril / apă (30/70), volumul probei 10 μl, lungime de undă de excitație 340 nm, detectare 450 nm pentru aflatoxine, 330-460 nm pentru ochratoxină A și 276-460 pentru Zearalenonă.

În al doilea rând, micotoxinele trichotocene (deoxinivalenol, nivalenol, NT-2, T-2, diacetooxisirpetol, 13-acetildeoxinivalenol, 15-acetildeoxinivalenol), zearalenonă, patulină, ochratoxină A prin cromatografie gaz-lichid cu detector. Condiții de cromatografie: coloană capilară "OPTIMA ® - 5 - Accent" (Macherey - Nagel, Germania, 30 m), temperatura termostatului coloanei 120 ° С, temperatura evaporatorului 200 ° С, detectorul 300 ° С. Temperatura termostatului coloanei este de 120-310 ° C (rata de încălzire este de 15 grade / min), gazul purtător este azot, volumul probei injectate este de 1 μL fără divizarea debitului.

În cel de-al treilea - patulină și zearalenonă prin HPLC cu detectare a diodelor. Condiții cromatografice: coloană cromatografică "XTerra RP18", 150 mm, fază mobilă - acetonitril / apă (gradient 4-80% acetonitril), viteza de alimentare a fazei mobile 1 ml / min, volumul probei injectate 10 μl, detectarea la lungimi de undă analitice 236 și 270 nm.

Principalele caracteristici metrologice ale determinării micotoxinelor în condiții optime prin această metodă cu adăugările introduse de standarde de micotoxină la cereale, carne și furaje la trei niveluri de concentrație sunt prezentate în tabel.

Durata determinării micotoxinelor indicate în tabel este de 1,5-2 ore cu operație simultană pe 3 cromatografe. Pregătirea probei necesită 10,1 ml acetonitril, 0,9 ml cloroform și 0,05 ml hexan. Coeficientul de concentrație este de aproximativ 3 ori mai mare comparativ cu prototipul, ceea ce duce la o determinare mai sensibilă a acestor micotoxine. Utilizarea diferitelor opțiuni de cromatografie pentru determinarea patulinei, zearalenonei, ochratoxinei A duce la rezultate de analiză mai fiabile.

masa
Caracteristici metrologice de bază pentru determinarea micotoxinelor
	Timp de retenție, t R, min	Domeniul de conținut determinat, mg / kg		Factorul de concentrare, K
Micotoxină			Introdus, mg / kg		Rata de recuperare, R,%

ÎN 1	24,2	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	100-109
ÎN 2	10,3	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,2-7,8	88-91
G1	20,6	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	98-100
G2	8,2	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005:0,001	7,6-7,8	86-98
T-2	19,7	0,01-3	0,01; 1,0; 2,0	6,1-7,3	80-90
NT-2	18,1	0,003-0,3	0,005;0,01;0,1	6,4-6,9	82-83
DON	14,2	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	7,6-8,9	98-100
zone	18,7	0,01-2	0,01: 1,0; 2,0	6,8-7,5	87-94
3-ADON	16,5	0,01-2	0,01:1,0:2,0	6,8-7,5	89-97
15-ADON	15,7	0,01-2	0,005:0,01:0,1	6,1-7,7	87-88
Nivalenol	14,3	0,003-0,3	0,005:0,01:0,1	6,4-7,5	85-97
DAS	16,7	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	6,0-7,3	76-98
OTA	11,4	0,002-0,2	0,005:0,01:0,1	6,5-7,7	87-96
Patulin	7,1	0,01-2	0,01; 1,0: 2,0	6,8-7,8	89-96
DON - deoxinivalenol, ZON - zearalenonă, 13, 15-ADON - acetildeoxinivalenol, DAS - diacetooxisirpenol, OTA - ochratoxină A

REVENDICARE

O metodă pentru determinarea micotoxinelor în produsele de origine animală și vegetală, inclusiv prelevarea de probe, extracția micotoxinelor cu acetonitril în prezența agenților de sărire, purificarea extractului cu sorbenți în vrac (metoda de preparare a probei conform QuEChERS), centrifugare și determinarea prin metode cromatografice, caracterizată prin aceea că extracția micotoxinelor se efectuează din 2 g dintr-o probă, extractul purificat este împărțit în trei părți, câte 2 ml fiecare și utilizat ca dispersant în microextracția dispersivă lichid-lichid cu adăugarea la prima parte (pentru determinarea aflatoxinelor, zearalenonei și ochratoxinei A) 300 μl de cloroform conținând 0,05% iod, a doua (pentru determinarea micotoxinelor trichotocene, patulinei, zearalenonei, ochratoxinei A) - 300 μl de cloroform conținând 50 μl de trifluoroacetic anhidridă, până la al treilea (pentru determinarea patulinei și zearalenonei) - 300 μl de cloroform, apoi amestecurile rezultate sunt injectate fiecare separat folosind o seringă în 5 ml de apă, situată în centrifugă eticheta cu o capacitate de 15 ml cu fund conic, incubată timp de 30 s într-o baie cu ultrasunete, centrifugată la 3000 rpm timp de 5 minute, straturile inferioare ale extractului sunt luate în microflaconi, solventul este purjat cu azot și reziduul în primul și al treilea microflaconi se dizolvă în 50 μl de acetonitril, în al doilea - în 50 μl hexan, în primul microflacon aflatoxinele (B1, B2, G1, G2), zearalenona și ochratoxina A sunt determinate prin HPLC cu un detector fluorometric , în a doua - micotoxine trichotocene (deoxinivalenol, nivalenol, NT-2, Tox-2, 13-, 15-acetildeoxinivalenol), patulină, ochratoxină A și zearalenonă prin cromatografie gaz-lichid cu detector de captare electronică, în a treia - patulină și zearalenonă prin HPLC cu un detector de diode.

Metode de determinare a micotoxinelor

Metodele moderne de detectare și determinare a conținutului de micotoxine din alimente și furaje includ metode de screening, metode cantitative, analitice și biologice. Metodologia micotoxinei evoluează foarte rapid. Numărul de metode dezvoltate și diverse modificări a ajuns deja la câteva sute și continuă să crească.

Metodele de screening simple și rapide pentru efectuarea analizelor vă permit să „eliminați” rapid și fiabil probele necontaminate. Acestea includ metode atât de răspândite, cum ar fi testul minicolumn pentru aflatoxine, ochratoxină A și zearalenonă; Metode TLC pentru determinarea simultană a până la 30 de micotoxine diferite; detectarea fluorescentă a contaminării cu aflatoxine etc.

Metodele analitice cantitative pentru determinarea micotoxinelor pot fi împărțite în imunoanaliză chimică, radioimunochimică și enzimatică. Metodele chimice sunt în prezent cele mai frecvente și includ etape secvențiale de izolare și determinare cantitativă reală a micotoxinelor. Etapa de izolare constă din două etape: extracția - separarea micotoxinei de substrat și purificare - separarea micotoxinei de compuși cu caracteristici fizico-chimice similare. Separarea finală a micotoxinelor se realizează folosind cromatografia cu strat subțire (TLC) pe una sau două dimensiuni pe plăci de silicagel în diferite sisteme de solvenți, cromatografie gaz și gaz-lichid, cromatografie lichidă de înaltă performanță și spectrometrie de masă. Determinarea cantitativă a micotoxinelor se efectuează de obicei prin compararea directă a intensității fluorescenței în timpul TLC în lumină ultravioletă cu standarde de concentrație cunoscută, atât vizual, cât și densitometric. Pentru a crește fiabilitatea metodelor, se utilizează diferite teste de confirmare, bazate pe prepararea derivaților de micotoxină cu diferite caracteristici cromatografice, colorimetrice sau fluorimetrice.

Ultimii ani s-au caracterizat printr-o atenție sporită la dezvoltarea unor metode de imunoanaliză radioimunochimică și enzimatică foarte sensibile și foarte specifice pentru detectarea, identificarea și cuantificarea micotoxinelor. Aceste metode se bazează pe obținerea de antiseruri la conjugatele micotoxinei cu albumina serică bovină. Avantajul lor este sensibilitatea lor excepțională, care face posibilă detectarea picogramelor de micotoxine și efectuarea de evoluții în direcția automatizării procesului de determinare. Metodele biologice, care de obicei nu sunt foarte specifice și sensibile, sunt utilizate în principal pentru detectarea micotoxinelor pentru care nu sunt disponibile metode chimice de analiză sau ca teste de confirmare. Obiectele testate sunt diferite microorganisme, embrioni de pui, multe animale de laborator, culturi de celule și țesuturi.

Vizualizări