Методы определения микотоксинов и контроль за загрязнением пищевых продуктов. Действие микотоксинов на организм человека

Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.

Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. В настоящее время наиболее распространенными являются химические методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсальным методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющейся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характеризовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и распределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сыпучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер: в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошибку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами все продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднородности (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотые зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жидкости: молоко, растительные масла, соки, пюре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов l-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (гомогенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатоксинов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфичности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или, флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т -2 токсин при обработке пластин; концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией;) в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов являются следующие:

Газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием УФ-фотометрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксинов; и зеараленона).

На рис. 2 представлено устройство современного жидкостного хроматографа в простейшем исполнении.

Подвижная фаза из емкости 1 через входной фильтр 9 подается насосом высокого давления 2 в систему ввода образца 3 - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее через фильтр 8 образец с током подвижной фазы поступает через предколонку в разделительную колонку 4. Затем поток подвижной фазы, выходящий из колонки и содержащий компоненты разделяемой смеси (элюат), поступает в детектор 5 и удаляется в сливную емкость 7. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор 6 или в компьютер.

Устройство жидкостного хроматографа (изократическая система):

1 - емкость; 2 - система высокого давления; 3 - ручной инжектор или автосамплер; 4 - разделительная колонка; 5 - детектор; б - регистратор или компьютер; 7 - сливная емкость; 8 - фильтр; 9 - входной фильтр

Система, приведенная на рис. 2, является изократической: в процессе хроматографирования состав подвижной фазы не изменяется. Если в ходе хроматогфического анализа необходимо изменять концентрацию одного или нескольких компонентов подвижной фазы, то применяют так называемые градиентные системы, состоящие обычно из двух или более насосов. В случае градиентного элюирования каждый растворитель подается из отдельного сосуда в специальную смесительную камеру с магнитной мешалкой, где по определенной программе происходит их смешивание с заданным соотношением объемов.

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку ой от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специальным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотометрический детектор является наиболее распространенным видом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектрофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюента протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фотоприемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно регистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуориметрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов B 1 и М 1 длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны испускаемого излучения - 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуориметрического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детектирование.

Д.М. Зубовский, Государственное учреждение «Белорусский государственный ветеринарный центр», главный ветеринарный врач

Дальнейшее развитие метод получил под названием высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ, HPTLC). Уменьшение толщины слоя неподвижной фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5 мкм), привело к лучшему разделению веществ за более короткий период времени.
Методы ТСХ доступны почти для всех микотоксинов. Обнаружение и специфическая идентификация разработана для каждого отдельного микотоксина, используя молекулярные свойства или реакции трансформации веществ.

Главные недостатки тонкослойной хроматографии:
§ малая производительность;
§ большинство образцов нуждается в этапах экстракции и очистки для удаления потенциальных помех и матричных соединений перед анализом;
§ концентрация анализируемого вещества должна быть в диапазоне 0,01-0,1 %;
§ использование токсичных и летучих веществ в качестве растворителя.
Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в области исследования микотоксинов главным образом используются для заключительного отделения матричных соединений и обнаружения интересующего анализируемого вещества. В настоящее время методы ВЭЖХ широко распространены из-за их превосходящих характеристик и надежности по сравнению с тонкослойной хроматографией. Методы ВЭЖХ были разработаны для большинства основных микотоксинов в зерновых культурах и другой сельскохозяйственной продукции. Большинство методов надежны и стабильны.
Метод ВЭЖХ основан на разделении анализируемого экстракта в неподвижной фазе хроматографической колонки (рисунок 3) (для анализа микотоксинов чаще используются колонки С8 и С18) и дальнейшей их идентификации и количественном определении с помощью специальных детекторов. Наиболее распространенными детекторами для анализа микотоксинов в настоящее время являются ультрафиолетовый и флюоресцентный.
Пределы чувствительности методов ВЭЖХ с применением данных детекторов могут доходить до 1 мкг/кг образца.
В литературе сообщалось о разработке методов ВЭЖХ для одновременного анализа нескольких микотоксинов. Особенно успешно таким образом анализируются трихотеценовые микотоксины, в частности трихотецены.

На практике для исследования кормов и продуктов питания в полевых условиях, условиях производственных и испытательных лабораторий требуются методы, позволяющие количественно и быстро исследовать большое число образцов на наличие микотоксинов, по возможности с наименьшими затратами сил и финансовых средств.
Всем этим характеристикам отвечают методы на основе иммунологических реакций. Коммерчески доступные иммунологические методы для анализа микотоксинов базируются на применении специфических моноклональных и поликлональных антител против определенных токсинов, и в целом делятся на:
§ метод на основе иммуноафинных колонок (ИАК, IAC);
§ иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) (таблица 1).

Обычно, иммуноафинные колонки фактически используются для очистки образца от матричных соединений и позволяют провести выделение и концентрирование определенного микотоксина.
Следующая за этим элюция токсина из ИАК позволяет провести количественное определение с использованием классических аналитических методов. В случае проведения иммуноферментного анализа, процедуры очистки обычно не столь интенсивны как при других аналитических методах. Гомогенат или экстракт образца, содержащий микотоксин, или непосредственно исследуется количественно, используя стандартный микротитровальный планшет или пробирочный анализ формата ИФА, или используется иммуноферментный мембранный тест для проведения качественного или полуколичественного определения наличия микотоксинов.
Другие методы по исследованию микотоксинов, использующие иммунологический подход, о которых сообщается в литературе, включают оптические и акустические биосенсоры, капиллярный электрофорез.

Иммуноафинные колонки обычно используются для очистки исследуемого образца от сложных матриц и концентрации токсинов перед обнаружением и оценкой содержания микотоксина, используя ряд классических аналитических методов, таких как ВЭЖХ, газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуорометрия, ВЭТСХ и ТСХ. Метод заключается во введении экстракта образца в колонку, содержащую иммуноафинную матрицу, содержащую твердую фазу (например, гранулы агарозы), к которой ковалентно присоединены антитела против микотоксина (рисунок 4). Молекула токсина, содержащаяся в образце, присоединяется к соответствующему иммобилизированному антителу. Последующие шаги включают удаление несвязанных матричных компонентов и экстрагента, элюцию токсина, изменяя элюирующий состав и, наконец, обнаружение токсина, используя аналитические методы. Как альтернатива, микотоксин, связанный в колонке, может быть элюирован и непосредственно измерен флюорометрией, основанной на собственной флюоресценции микотоксинов.
Мембранный тест позволяет за короткий период времени (около 10-15 мин) дать ответ на вопрос: присутствуют ли в испытуемом образце микотоксины выше уровня предела чувствительности данного теста? То есть фактически это качественное определение наличия/отсутствия микотоксинов в пробе. Метод требует экстракции, фильтрации, очистки (через колонку) и разведения образца. Далее раствор наносится на мембрану сенсибилизированную моноклональными антителами, куда также добавляется ферментный конъюгат микотоксина. Если концентрация микотоксинов в образце превышает предел чувствительности теста, все антитела на поверхности связываются с ними и весь добавленный конъюгат удаляется на этапе отмывки. При добавлении бесцветного субстрата конъюгат на поверхности мембраны катализирует цветную реакцию, в результате которой на месте связывания конъюгата образуется цветное пятно. Окрашивание аналитической зоны мембраны говорит об отсутствии микотоксинов в образце.
Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия микотоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце. В настоящее время доступен ряд качественных, полуколичественных и количественных методов. Основываясь на результатах ИФА подозрительные образцы должны быть перепроверены классическими методами. Доступны различные варианты ИФА для анализа микотоксинов (например, мембранные тесты, микротитровальные планшеты и пробирочные методы). Как правило, метод ИФА основан на конкурентом анализе, который использует или связанные с ферментным конъюгатом микотоксины, или антитела против определенного анализируемого токсина (рисунок 5). Типичная последовательность реакций, используя готовые реактивы в формате микротитровального планшета следующие:
1. ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;
2. смесь добавляется к соответствующим антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета (например, микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами);
3. количество соединенного с токсином конъюгата, связываемое иммобилизированными антителами зависит от количества токсина в образце; чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество ферментного конъюгата присоединившегося к антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета и наоборот;
4. ферментативная активность связанного с поверхностными антителами конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце.

На базе Белорусского государственного ветеринарного центра нами в течение 2004-2006 г.г. проводился анализ содержания микотоксинов в кормах с использованием иммуноферментного метода. Для исследования применялись готовые тест-системы производства компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией выпускается ряд наборов для количественного определения микотоксинов: афлатоксины В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, фумонизин В1, цитринина. Следует отметить, что практически для всех перечисленных микотоксинов существуют варианты тест-систем для определения особо малых концентраций этих токсичных соединений с пределом чувствительности на уровне хроматографических методик (RIDASCREEN® Mycotoxins) (время инкубации 1-2 часа) и экспресс-методы, позволяющие определять практически такие же концентрации в течение 15-30 минут (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Все методики прошли утверждение в Республике Беларусь и могут использоваться в лабораториях, входящих в структуру Министерства сельского хозяйства и продовольствия.
Организация анализа микотоксинов в кормах и пищевых продуктах иммуноферментным методом возможна минимальными средствами и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от классических методов анализа (таблицы 2, 3) и делают его особенно привлекательным для лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями.
Необходимо отметить, что при практически равных показателях пределов обнаружения методы иммуноферментного анализа являются более производительными и позволяют проводить избирательное исследование только подозрительных по ИФА образцов инструментальными методами. Например, методом ИФА один лаборант может провести исследование 10-100 образцов за одну рабочую смену, в то время как при использовании ВЭЖХ – только 1-10 проб. При этом на проведение иммуноферментного анализа затрачивается от 15 минут до 3 часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом ВЭЖХ – 2-4 часа при 1-3-дневной пробоподготовке.

Выводы. Проведение исследований по выявлению загрязнения кормов микотоксинами за этот период позволило диагностировать внезапно возникшие вспышки заболеваний в нескольких хозяйствах республики, что дало возможность применить адекватные меры и тем самым снизить экономические потери производителей.
Затраты на своевременное исследование кормов собственного производства, а тем более закупаемых в других странах, всегда окажутся ниже, чем затраты на проведение экстренной диагностики вспыхнувшего заболевания, принятие необходимых мер по использованию или утилизации загрязненных кормов, а также потери от снижения продуктивности и гибели животных.

Литература:
1. Bioaerosols: Assessment and Control, 24.1.3. – ACGIH, Cincinnati, OH 1999.
2. Ветеринарно-санитарные нормы по безопасности кормов и кормовых добавок: : №48: утв. М-вом сельского хозяйства и продовольствия РБ от 28.04.08: ввод. в действие 28.04.08.
3. Европейская информационная сеть по микотоксикологии. – http://www.mycotoxins.org
4. Постановление Комиссии ЕС № 466/2001 от 8 марта 2001 года «Устанавливающая максимально допустимые уровни определенных контаминантов в продуктах питания». – OJ L 77, 16.3.2001. – p. 1.

Микотоксины и методы их определения

Микотоксины (от греч. mykes - гриб и toxikon - яд) - это вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами. Высокая опасность микотоксинов выражается в том, что они обладают токсическим эффектом в чрезвычайно малых количествах и способны весьма интенсивно диффундировать в глубь продукта.

Афлатоксины являются представителями наиболее опасной группы мико­токсинов, обладающих сильными гепатотоксилескими и канцерогенными свойст­вами. Продуцентами афлатоксинов являются различные штаммы только двух видов аспергилл (Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus), которые широко распространены во всем мире. Следует отметить, что токсигенные грибы могут поражать растительные субстраты не только во время хранения, но и в процессе их роста, сбора урожая, транспортирования и переработки.

Семейство афлатоксинов включает четыре основных представителя (афла­токсины В 1 , В 2 , G 1 , G 2), а также более 10 соединений, являющихся производными или метаболитами основной группы (М 1 , М 2 , В 2а, G 2а, GM 1 , Р 1 , Q 1 и др.).

В природных условиях чаще и в наибольших количествах афлатоксины обнаруживаются в арахисе, кукурузе, семенах хлопчатника. Кроме того, в зна­чительных количествах они могут накапливаться в различных орехах, семенах масличных культур, пшенице, ячмене, зернах какао и кофе, а также в кормах для сельскохозяйственных животных.

Следует отметить возможность появления афлатоксинов в продуктах жи­вотного происхождения: в молоке, тканях и органах животных, получавших корм, загрязненный афлатоксинами в высоких концентрациях.

Доказано, что коровы экскретируют с молоком от 0,35 до 2-3 % получен­ного с кормом афлатоксина В 1 в виде высокотоксичного метаболита - афлатоксина М 1 При этом пастеризация молока и процесс высушивания не оказывают существенного влияния на содержание в нем афлатоксина М 1 . Афлатоксин М 1 был обнаружен как в цельном, так и в сухом молоке и даже в молочных продуктах, подвергшихся технологической обработке (пастеризация, стерилизация, приготовление творога, йогурта, сыров и т. п.). Так, в процессе получения сыра из контаминированного молока 50 % афлатоксина М 1 определяется в творожной массе. При получении масла 10 % афлатоксина М 1 переходит в сливки, 75 % ос­тается в снятом молоке.

Афлатоксины слабо растворимы в воде, нерастворимы в неполярных рас­творителях, но легко растворимы в растворителях средней полярности, таких как хлороформ, метанол и диметилсульфоксид. Они достаточно нестабильны в химически чистом виде и чувствительны к воздействию воздуха и света.

Афлатоксины практически не разрушаются при ооычнои кулинарной оораоотке кон-таминированных пищевых продуктов.

Трихотеценовые микотоксины являются вторичными метаболитами мик­роскопических грибов рода Fusarium, которые поражают корма и пищевые про­дукты, вследствие чего у животных и человека возникает алиментарный токси­коз. Чаще всего они обнаруживаются в зерне кукурузы, пшеницы и ячменя. Ми­котоксины этой группы отличаются повсеместным распространением, особенно в странах с умеренным континентальным климатом. Нередко в одном и том же продукте обнаруживают два или более микотоксинов. При проведении обяза­тельной сертификации предусмотрен контроль за содержанием двух представи­телей этой грутпты, а именно нормируются дезоксиниваленол и Т-2 токсин.

Дезоксиниваленол (ДОН) - один из распространенных фузариотоксинов - подавляет синтез белка, снижает концентрацию итгуногаобулинов в сыворотке крови, может подавлять ре1фодуктивную систему. Особенно опасным является загрязнение кормов для сельскохозяйственных животных. Так, ДОН вызывает у животных рвоту, снижает потребление корма у поросят. Т-2 токсин распростра­нен менее широко, но более токсичен, чем ДОН. Т-2 токсин вызывает раздраже­ние, кровоизлияния и некроз в пищеварительном тракте. Острая интоксикация трихотеценами сопровождается поражением органов кроветворения и иммуно-компетентных органов. Характерны развитие геморрагического синдрома, отказ от корма, рвота.

Зеараленон и его производные также продуцируются микроскопическими грибами рода Fusarium. Основным природным субстратом, в котором наиболее часто обнаруживается зеараленон, является кукуруза. Грибы рода Fusariurn gra-minearum часто поражают кукурузу в поле на корню и являются причиной гнили початков и стеблей. Контаминация кукурузы зеараленоном может происходить и при хранении. Высока частота обнаружения зеараленона в комбикормах, а так­же в пшенице, ячмене и овсе. Среди пищевых продуктов этот токсин был обна­ружен в кукурузной муке, хлопьях и кукурузном пиве.

Зеараленон обладает выраженным эстрогенным и тератогенным действи­ем и представляет серьезную проблему для животноводства во многих странах, а способность этого микотоксина накапливаться в тканях сельскохозяйственных животных делает его потенциально опасным для здоровья человека. Загрязне­ние кормов зеараленоном вызывает снижение плодовитости, аборты, бесплодие и воспалительные заболевания у свиней, коров, до­машней птицы и кроликов. Несмотря на это, неко­торые производные зеараленона до последнего вре­мени использовались в качестве стимуляторов роста животных и достаточно широко производились про­мышленностью.

Патулин - особо опасный микотоксин, обладающий канце­рогенными и мутагенными свойствами. Основными продуцентами патулина являются микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium expansum. Продуценты патулина поражают в основном фрукты и некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах, абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике, облепихе, айве, томатах. Наиболее часто патулином поражаются яблоки, где содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг. Следует отметить, что патулин обнаруживают не только в подгнив­шей части фруктов и овощей, но и в нормальной. Например, в томатах патулин распределяется равномерно по всей ткани.

Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах переработ­ки фруктов и овощей: соках, компотах, mope и джемах. Особенно часто его находят в яблочном соке (0,02-0,4 мг/л). Содержание патулина в других видах соков: груше­вом, айвовом, виноградном, сливовом, манго - колеблется от 0,005 до 4,5 мг/л.

Контроль за содержанием микотоксинов является обязательным при прове­дении сертификации продовольственного сырья и пищевых продуктов. В России приняты санитарно-гигиенические нормативы по содержанию микотоксинов в продуктах питания, приведенные в табл. 12.

Система мер профилактики микотоксикозов включает санитарно-микологический анализ пищевых продуктов (рис. 13).

Таблица 12. Допустимые уровни содержания микотоксинов в отдельных группах пищевых продуктов

Кроме того, большое внимание уделяется изысканию способов деконтаминации и детоксикации сырья и пищевых продуктов, загрязнешгых микотоксинами. С этой целью используют механические, физические и химические методы:

1) механические - отделение загрязненного материала вручную или с по­мощью электронно-калориметрических сортировщиков;

2) физические термическая обработка, облучение ультрафиолетовой ра­диацией;

3) химические - обработка растворами окислителей, сильных кислот и ос­нований.

Однако применение механических и физических методов очистки не дает высокого эффекта, химические методы приводят к разрушению не только мико­токсинов, но и полезных нутриентов, а также к нарушению их всасывания.

Рис. 12.Санитарно-микробиологический анализ пищевых продуктов

14.8.1 Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотокси­нов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количествен­ные аналитические и биологические методы.

Скрипипг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения се­рийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и не­загрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослой­ной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и имлгуноферментны-ми методами. В настоящее время наиболее распространенными являются хими­ческие методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количес­твенного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от со­единении с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсалыгым методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющей­ся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характери­зовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и рас­пределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сы­пучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер:

в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошиб­ку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами вес продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднороднос­ти (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотыс зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жид­кости: молоко, растительные масла, соки, шоре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов 1-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (го­могенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих вели­чине среднего образца (100 200 г), при условии, что продукт происходит из од­ной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатокси­нов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфич­ности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т-2 токсин при обработке пластин концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов яв­ляются следующие:

Газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использова­нием УФ-фотомстрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксипов и зеараленона).

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы ВЭЖХ, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку длиной от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специаль­ным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотомеорический детектор является наиболее распространенным ви­дом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектлзофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюен-та протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фото­приемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно ре­гистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуори­метрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет про­точную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов В 1 и М 1 длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны ис­пускаемого излучения - 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуоримет-рического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детекти­рование.

Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Отбирают полученные экстракты в микрофлаконы, производят выпаривание растворителя и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана. В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Продолжительность определения микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к пищевой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано при определении содержания микотоксинов в пищевых продуктах, зерновых культурах, комбикормах и мясе с целью оценки их безопасности.

Методик определения всех нормируемых микотоксинов из одной навески в настоящее время не предложено. Известны способы определения отдельных микотоксинов или отдельных классов.

Так, для определения зеараленона, Т-2, охратоксина А применяют тонкослойную хроматографию для каждого токсина отдельно (ГОСТ 28001-88. Методы определения микотоксинов Т-2, зеараленона и охратоксина А. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма). Метод чрезвычайно сложный, длительный и позволяет полуколичественно определить указанные микотоксины каждого из отдельной навески.

Известен способ определения афлатоксинов (B1, B2, G1, G2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ГОСТ Р 53162-2008. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1, G2). Афлатоксины экстрагируют метанолом, экстракт очищают и концентрируют на иммуноаффинной колонке, элюируют метанолом, упаривают до малого объема и хроматографируют. Методика длительна, дорогостояща и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ определения дезоксиниваленола (ГОСТ Р 51116-97. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола), основанный на извлечении микотоксина из пробы ацетонитрилом, очистке экстракта на двух последовательных колонках с углем, элюировании дезоксиниваленола ацетонитрилом, упаривании экстракта до малого объема и анализ методом жидкостной хроматографии с УФ-детектором. Однако предлагаемый способ длителен, трудоемок и не позволяют одновременно определить все микотоксины.

Известен способ определения патулина (Патент РФ № 2056044, G01N 33/02. Способ количественного определения патулина в пищевых продуктах), основанный на извлечении патулина из пробы этилацетатом, очистке экстракта на адсорбенте, концентрировании экстракта и анализе методом жидкостной хроматографии. Методика длительна и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ одновременного определения трихотоценовых микотоксинов и зеараленона в зерне методом газовой хромато-масс-спектрометрии (Toshitsuga Tanaka at al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry / J.Chromatogr. A. 2000. 882. P.23-28). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 10 г навески 100 мл ацетонитрила в течение 30 мин, удалении жира экстракцией 20 мл гексана, упаривании ацетонитрильного экстракта досуха, растворении сухого остатка в смеси метанола с хлороформом, очистки экстракта на колонке с флорисилом, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в 2 мл метанола, дериватизации тетраметилсиланом и затем хроматографировании. Способ длителен, трудоемок и дорогостоящ.

Известен способ одновременного определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона в зерне методом высокоэффективной хроматографии с флуориметрическим детектором (Gobel R., Lusky К. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquit chromatography / Food Chemical Contaminants. 2004. V.87. № 2. P.411-418). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора ацетонитрила, очистки экстракта на иммуноаффинной колонке, извлечении из колонки микотоксинов 2 мл метанола, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в гексане, дериватизации трифторуксусной кислотой 15 мин, упаривании досуха, растворении остатка в метаноле и определении микотоксинов при разных длинах волн (афлатоксины - 360-440 нм, зеараленон - 276-466 нм и охратоксин А - 330-460 нм). Способ длителен и трудоемок, требует большого количества растворителей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ одновременного определения афлатоксинов в зерновых продуктах (Campone L., Piccinelli A.L., Cetano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in cereal products / J.Chromatogr. A.2011. 1248. P.7548-7554). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора метанола, удалении жира экстракцией 6 мл гексана, очистки 1 мл экстракта с использованием дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции хлороформом (220 мкл), удалении хлороформа, растворении остатка в 0,1 мл метанола и определении афлатоксинов методом ФЭЖХ с флуориметрическим детектором. Коэффициент концентрирования микотоксинов составляет 2,0-2,5. Однако метод длителен, требует большого количества растворителей, мал коэффициент концентрирования и не дает возможности определения других микотоксинов из этого же экстракта. Продолжительность анализа только для афлатоксинов составляет 1,5-2 часа.

Цель изобретения - сокращение продолжительности анализа, увеличение воспроизводимости и надежности результатов анализа, сокращение расхода органических растворителей и обеспечение безопасности оператора.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения микотоксинов, включающему отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck F.J. // J. AOAC Int. 2003. V.86. № 2. P.412), центрифугирование и определение хроматографическими методами. В предлагаемом способе экстракцию проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13- и 15-ацетилдезоксиниваленол, патулин, зеараленон, охратоксин А) методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.

Пример определения микотоксинов. В пробирку вместимостью 50 мл помещают 2,000 г измельченного продукта (зерно, комбикорм, мясо), добавляют 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды, энергично встряхивают 5 мин, высыпают смесь солей (4 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 1 г цитрата натрия одноводного и 0,5 г цитрата натрия 1,5-водного), закрывают и энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают 8 мл полученного экстракта в пробирку вместимостью 15 мл, содержащую 0,9 г сульфата магния, по 0,2 г сорбентов Bondesil PSA и С18, энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.

В три пробирки отбирают по 2 мл полученного экстракта. В первую вносят 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, во вторую - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, в третью - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси каждую отдельно впрыскивают с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в конических центрифужных пробирках, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне и центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстрактов в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана.

В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Условия хроматографирования: колонка «Kromasil С18», 150 мм, подвижная фаза ацетонитрил/вода (30/70), объем пробы 10 мкл, длина волны возбуждения 340 нм, детектирования 450 нм для афлатоксинов, 330-460 нм для охратоксина А и 276-460 для зеараленона.

Во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпетол, 13-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдезоксиниваленол), зеараленон, патулин, охратоксин А методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов. Условия хроматографирования: капиллярная колонка «OPTIMA ® - 5 - Accent» (Macherey - Nagel, Германия, 30 м), температура термостата колонки 120°С, температура испарителя 200°С, детектора 300°С. Температура термостата колонки 120-310°С (скорость нагрева 15 град./мин), газ-носитель - азот, объем вводимой пробы 1 мкл без деления потока.

В третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Условия хроматографирования: колонка хроматографическая «XTerra RP18», 150 мм, подвижная фаза - ацетонитрил/вода (градиент 4-80% ацетонитрила), скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, детектирование при аналитических длинах волн 236 и 270 нм.

Основные метрологические характеристики определения микотоксинов в оптимальных условиях по данной методике при введенных добавках стандартов микотоксинов в зерно, мясо и комбикорма на трех уровнях концентраций указаны в таблице.

Продолжительность определения для указанных в таблице микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Коэффициент концентрирования примерно в 3 раза выше по сравнению с прототипом, что приводит к более чувствительному определению указанных микотоксинов. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа.

Таблица
Основные метрологические характеристики определения микотоксинов
	Время удержи-вания, t R , мин	Диапазон определяемых содержании, мг/кг		Коэффициент концентрирования, К
Микотоксин			Введено, мг/кг		Степень извлечения, R, %
В1	24,2	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	100-109
В2	10,3	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,2-7,8	88-91
G1	20,6	0,00005-0,001	0,00005; 0,0005; 0,001	7,8-8,0	98-100
G2	8,2	0,00001-0,001	0,00005; 0,0005:0,001	7,6-7,8	86-98
Т-2	19,7	0,01-3	0,01; 1,0; 2,0	6,1-7,3	80-90
НТ-2	18,1	0,003-0,3	0,005;0,01;0,1	6,4-6,9	82-83
ДОН	14,2	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	7,6-8,9	98-100
зон	18,7	0,01-2	0,01: 1,0; 2,0	6,8-7,5	87-94
3-АДОН	16,5	0,01-2	0,01:1,0:2,0	6,8-7,5	89-97
15-АДОН	15,7	0,01-2	0,005:0,01:0,1	6,1-7,7	87-88
Ниваленол	14,3	0,003-0,3	0,005:0,01:0,1	6,4-7,5	85-97
ДАС	16,7	0,01-2	0,01; 1,0:2,0	6,0-7,3	76-98
ОТА	11,4	0,002-0,2	0,005:0,01:0,1	6,5-7,7	87-96
Патулин	7,1	0,01-2	0,01; 1,0: 2,0	6,8-7,8	89-96
ДОН - дезоксиниваленол, ЗОН - зеараленон, 13, 15-АДОН - ацетилдезоксиниваленол, ДАС - диацетооксискирпенол, ОТА - охратоксин А

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения, включающий отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS), центрифугирование и определение хроматографическими методами, отличающийся тем, что извлечение микотоксинов проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, зеараленона и охратоксина А) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.

Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные, аналитические и биологические методы. Методология микотоксинов развивается очень быстро. Число разработанных методов и различных модификаций достигло уже нескольких сотен и продолжает нарастать.

Скрининг-методы, отличающиеся простотой и быстротой проведения анализов, позволяют быстро и надежно "отсеивать" незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный способ выявления афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; ТСХ-методы для одновременного определения до 30 различных микотоксинов; флюоресцентный метод обнаружения загрязнения афлатоксинами, и др.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов могут быть подразделены на химические, радиоиммунохимические и иммуноферментные. Химические методы в настоящее время являются наиболее распространенными и включают последовательные стадии выделения и собственно количественного определения микотоксинов. Стадия выделения состоит из двух этапов: экстракция - отделение микотоксина от субстрата, и очистка - отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками. Окончательное разделение микотоксинов осуществляют с помощью одно - или двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем в различных системах растворителей, газовой и газо-жидкостной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс - спектрометрии. Количественное определение микотоксинов проводят обычно путем прямого сравнения интенсивности флюоресценции при ТСХ в ультрафиолете со стандартами известной концентрации как визуально, так и денситометрически. Для повышения надежности методов применяют различные подтверждающие тесты, основанные на получении производных микотоксинов с иными хроматографическими, колометрическими или флюориметрическими характеристиками.

Последние годы характеризуются усилением внимания к разработке высокочувствительных и высокоспецифических радиоиммунохимических и иммуноферментных методов обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгантам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Преимуществом их является исключительная чувствительность, позволяющая выявлять пикограммы микотоксинов, и вести разработки в направлении автоматизации процесса определения. Биологические методы, обычно не отличающиеся высокой специфичностью и чувствительностью, применяются главным образом для выявления микотоксинов, для которых отсутствуют химические методы анализа, или в качестве подтверждающих тестов. Тест-объектами служат различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, многие лабораторные животные, культуры клеток и тканей .